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BIOHUB Polyethyleneimine PEI Pro (GMP) 聚乙烯亞胺PEI-Pro(GMP)說(shuō)明書

更新時(shí)間:2023-10-24      點(diǎn)擊次數(shù):199

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基本信息
    BIOHUB Polyethyleneimine PEI PRO(GMP)是GMP級(jí)別轉(zhuǎn)染試劑,本制品利用BIOHUB公司生產(chǎn)的線性陽(yáng)離子聚合物,按照符合GMP認(rèn)證管理體系下,采用藥用規(guī)格原輔料生產(chǎn),所用起始材料及所需化學(xué)品和配制過(guò)程均在無(wú)菌環(huán)境中操作進(jìn)行,以確保制造過(guò)程中每個(gè)步驟的特性、效力、純度和安全性的一致性 。并嚴(yán)格控制重金屬殘留、細(xì)菌內(nèi)毒素殘留等,生產(chǎn)工藝符合 GMP 規(guī)范的產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量管理規(guī)程,保障生產(chǎn)過(guò)程及所有原輔料可追溯。
   
  • PH值檢測(cè)通過(guò)中國(guó)藥典 2020 版第四部 pH 值測(cè)定法(通則 0631)

  • 檢測(cè)遵循《人用基因治療總論-中國(guó)藥典 2020》國(guó)家藥典委。

  • 檢測(cè)遵循USP Chapter<1043>, Ancillary Materials for Cell, Gene, and Tissue-Engineered Products 用于細(xì)胞治療,基因治療和組織工程產(chǎn)品中的輔料。

  • 細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)符合中國(guó)藥典2015版四部通則(1143)方法2光度測(cè)試法(動(dòng)態(tài)濁度法)

  • 重金屬殘留檢測(cè)符合國(guó)藥典 2020 版第四部重金屬檢查法(通則 0821)

  • 支原體檢測(cè) 使用支原體檢測(cè)試劑盒

質(zhì)量信息表

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產(chǎn)品特點(diǎn)
BIOHUB-PRO GMP在 HEK293和CHO大多數(shù)表達(dá)系統(tǒng)中,BIOHUB-PRO GMP 都能提供穩(wěn)定的高表 達(dá)(96 孔板至 100L 生物反應(yīng)器)?,F(xiàn)在每年有更多的研究人員和公司選擇使用 BIOHUB-PRO GMP 進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染.。
  • GMP級(jí)別定制監(jiān)管,支持并滿足合規(guī)要求。

  • 不含動(dòng)物源性成分。

  • 嚴(yán)格遵循以下規(guī)范生產(chǎn) 1. ISO 9001:2015, certified facility。

  • 嚴(yán)格按照《GMP 附錄-細(xì)胞治療產(chǎn)品》國(guó)家藥品監(jiān)督管理局。

  • 從工藝開(kāi)發(fā)到臨床試驗(yàn)和商業(yè)化的無(wú)縫過(guò)渡生產(chǎn)細(xì)胞系(HEK-293 和衍生物、VERO 等的最高病毒產(chǎn)量。

操作方法參考

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一、貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染 以 6 孔板轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞為例:
(一)轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備
1) 轉(zhuǎn)染前一天:用膠原酶 I型(78CL10002)消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)(不建議用胰酶)。 按照每孔2×10 6的細(xì)胞量接種293T 至 6 孔板(每孔加入 2ml 新鮮的 DMEM:F12+5%FBS wan全培養(yǎng)基和 1ml 的細(xì)胞懸液)置于 37°C,5%CO2培養(yǎng) 箱培養(yǎng) 24h。
2) 24h 后,移除之前培養(yǎng)基,每孔加入 2ml 新鮮的 DMEM:F12+5%FBS。
注意:確保 293T 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好傳代 不超過(guò) 15 代。
(二)轉(zhuǎn)染過(guò)程
3) 第一天:顯微鏡下檢查細(xì)胞匯合度, 當(dāng)細(xì)胞達(dá)到 70%到 80%的匯合度時(shí),開(kāi)始準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。
4) 對(duì)于每孔細(xì)胞,用 100µl 無(wú)血清培養(yǎng)基(如 OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基)稀釋 DNA 使 DNA 終濃 度為 1ug/ml(DNA/總培養(yǎng)體積)。
5) 對(duì)于每孔細(xì)胞,用 100μL 無(wú)血清培養(yǎng)基(如 OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基)稀釋適當(dāng)比例的適量 BIOHUB-PRO GMP 。DNA:BIOHUB-PRO GMP 的比例要依據(jù)自己實(shí)驗(yàn)摸索最適比例。
6) 將稀釋的 BIOHUB-PRO  GMP轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋的質(zhì)粒中(總體積 200µL)輕輕混勻, 室溫孵育 30 分鐘。
7) 小心地將 BIOHUB-PRO  GMP復(fù)合物滴加到細(xì)胞培養(yǎng)板每個(gè)孔中,輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板混勻。注 意加入混合液時(shí)輕輕沿著孔板邊緣滴入,而不是在細(xì)胞的頂部以免破壞細(xì)胞的粘附性。
8) 將培養(yǎng)板放入 37°C,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)中培養(yǎng) 24h。
(三)觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果 9) 第二天:在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率,通常超過(guò) 80%的 293T 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后的 24h 可以觀察到綠色熒光。 小貼士 :建議進(jìn)行不同基因轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)對(duì) BIOHUB-PRO GMP 和 DNA 的比例進(jìn)行優(yōu)化,以達(dá)到最適比例, 通常篩選范圍在 1:1 到 1:3 之間。如果之前用過(guò)進(jìn)口品牌的 PEI,用BIOHUB-PRO  GMP時(shí)應(yīng)適當(dāng) 降低使用濃度。
     通常情況下,分別準(zhǔn)備BIOHUB-PRO GMP GMP和 DNA 轉(zhuǎn)染溶液時(shí)其體積一般是轉(zhuǎn)染前每孔細(xì)胞培 養(yǎng)液體積總量的 1/10-1/20,如細(xì)胞培養(yǎng)液體積為 3ml,則稀釋BIOHUB-PRO  GMPI及 DNA 的體積為150ul。質(zhì)粒 DNA 的濃度通常為 1ug/ml(DNA 質(zhì)量/細(xì)胞培養(yǎng)總體積)[1][4]。 不同質(zhì)粒種類以及大小會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率,如較大片段插入質(zhì)??赡苻D(zhuǎn)染效率低,可根據(jù) 實(shí)際實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整,如適當(dāng)增加轉(zhuǎn)染質(zhì)??偭康取??HEK293 GnTI 細(xì)胞重懸浮可用槍頭或移液管反復(fù)吹打,但 CHO-S 細(xì)胞的粘附性比較強(qiáng) 重懸浮時(shí)需要借助細(xì)胞刮刀。 一般建議用膠原酶消化細(xì)胞,如果表達(dá)的是膜蛋白,胰酶消化細(xì)胞可能會(huì)降低蛋白表達(dá), 建議用膠原酶消化細(xì)胞,我們推薦用(78CL10002)的膠原酶。 對(duì)于貼壁性低的細(xì)胞系,可用明膠或鼠尾膠鋪板,增加細(xì)胞與培養(yǎng)皿之間的粘附性。 一旦確定了細(xì)胞類型、培養(yǎng)基和78BioPEI GMP與 DNA 的最佳比例,就可以在轉(zhuǎn)染后 24 至 96 小時(shí)內(nèi)多次觀察轉(zhuǎn)染效率,以優(yōu)化最大表達(dá)量時(shí)間點(diǎn)。
二、懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染 離心對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞用新鮮的培養(yǎng)基重懸浮使細(xì)胞密度達(dá)到 1×10 6cells/mL 小規(guī)模轉(zhuǎn) 染時(shí),如需大規(guī)模轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度要到達(dá) 2-3×10 6cellsml/mL。以 293F 細(xì)胞 于 100mL 培養(yǎng)瓶(溶液體積占瓶體積的 1/5)操作體系舉例如下:
(一)轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備
1) HEK293F 細(xì)胞傳代接種于 20mL 懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中(36.5℃,120rpm,5%CO2 )的條 件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度到 1X10 6cells/mL,然后旋緊瓶口放入搖床繼續(xù)培養(yǎng),2~4 小時(shí) 后可以進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
(二)轉(zhuǎn)染過(guò)程
2) 用 1mlOptiPRO™SFM(無(wú)血清培養(yǎng)基)稀釋適量的 DNA,使 DNA 終濃度為 1ug/ml(DNA/總 培養(yǎng)體積)?;靹虿㈧o置 5min。
3) 用1mlOptiPRO™SFM(無(wú)血清培養(yǎng)基)稀釋適當(dāng)比例的BIOHUB-PRO  GMP,混勻并靜置 10min。
(78BioPEI:DNA 參考比例范圍,可參考上述貼壁細(xì)胞BIOHUB-PRO  GMP和 DNA 優(yōu)化方案優(yōu)化)。
4) 將BIOHUB-PRO  GMP轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋的質(zhì)粒中輕輕混勻,室溫孵育 30 分鐘。
5) 將BIOHUB-PRO  GMP轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中,搖勻后旋緊瓶口放回?fù)u床 (36.5℃,5%CO2,120rpm)。
6) 基因表達(dá)可在 24-72 小時(shí)后檢測(cè),具體時(shí)間取決于細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因.
小貼士:在懸浮培養(yǎng)中,單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率要高于聚集在一起的細(xì)胞,需要優(yōu)化適合單細(xì)胞的 生長(zhǎng)條件。 方形瓶應(yīng)經(jīng)過(guò)兩個(gè)連續(xù)的干燥循環(huán)高壓滅菌(每個(gè) 45 分鐘,干燥 15 分鐘) 蓋子應(yīng)盡可能松,不得脫落。應(yīng)該讓它們冷卻擰緊蓋子前,將其wan全放入層流罩中。如 果瓶子向內(nèi)塌陷,細(xì)胞將無(wú)法正常生長(zhǎng)。 如果要獲得更多的蛋白產(chǎn)量,有參考文獻(xiàn)表明轉(zhuǎn)染后 24 小時(shí),可以適當(dāng)稀釋細(xì)胞,稀 釋比例參考范圍(1:2—1:5)之間,可以增加蛋白產(chǎn)量,稀釋效應(yīng)與最佳稀釋比率應(yīng)根 據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定, 可以把 DNA 和BIOHUB-PRO  GMP 轉(zhuǎn)染試劑直接加入到細(xì)胞懸液中進(jìn)行轉(zhuǎn)染,但必須經(jīng)過(guò)上述 特定流程的 DNA 和轉(zhuǎn)染試劑的比例和用量的相應(yīng)優(yōu)化。



注意事項(xiàng)

  1. 不同質(zhì)粒種類以及大小會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率,可如較大片段插入質(zhì)粒可能轉(zhuǎn)染效率低,可根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整,如適當(dāng)增加轉(zhuǎn)染質(zhì)??偭康?。

  2. 細(xì)胞狀態(tài)及代數(shù)會(huì)較大程度影響轉(zhuǎn)染。剛復(fù)蘇細(xì)胞需傳代2-3次以上,待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后做轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。為保證實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性,轉(zhuǎn)染細(xì)胞盡量選擇20代以內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

  3. 對(duì)于貼壁性低的細(xì)胞系,可用明膠或鼠尾膠鋪板,增加細(xì)胞與培養(yǎng)皿之間的粘附性。

  4. 初次使用應(yīng)優(yōu)化DNA濃度和 BIOHUB-PRO GMP試劑量以得到最大的轉(zhuǎn)染效率。 DNA 和轉(zhuǎn)染試劑的比例, 通常推薦是1:2-1:3,通過(guò)調(diào)整DNA/BIOHUB-PRO  GMP轉(zhuǎn)染試劑比例優(yōu)化轉(zhuǎn)染效率,調(diào)整范圍DNA(μg):BIOHUB-PRO  GMP(μL) 比值在1:0.5-1:5。

  5. 為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。



貨號(hào)品名規(guī)格品牌
78EF10003-5mlBIOHUB Polyethyleneimine PEI PRO(GMP)5mlBIOHUB
78EF10003-1LBIOHUB Polyethyleneimine PEI PRO(GMP)1LBIOHUB








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