產(chǎn)品描述
膠原酶(Collagenase)是一種蛋白酶,一種肽鏈內(nèi)切酶,能夠特異性的識別Pro-X-Gly-Pro序列(該序列高頻率出現(xiàn)在膠原中,很少發(fā)現(xiàn)于其他蛋白中)并切割該序列中性氨基酸(X)和甘氨酸(Gly)之間的肽鍵。許多蛋白酶都能水解單鏈且變性的膠原多肽,但膠原酶是唯yi一種可以降解具有三股超螺旋結(jié)構(gòu)的天然膠原纖維的蛋白酶,這種膠原纖維廣泛存在結(jié)締組織內(nèi)。
本品來源于溶組織梭菌(Clostridium histolyticum),是一種酶粗提物,不僅含有膠原酶(更準(zhǔn)確的稱法為梭菌蛋白酶A(clostridiopeptidase A)),能夠降解天然膠原和網(wǎng)狀纖維。還含有其他的一些蛋白酶、多糖酶、脂酶等,分別能夠有效水解結(jié)締組織和上皮組織細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的其他蛋白,多糖和脂質(zhì),使得本品非常適用于組織消化。
目前商業(yè)化提供的細(xì)菌膠原酶主要根據(jù)膠原酶活性的差異,分為四種類型:膠原酶I型,II型,III型和IV型,在應(yīng)用上有所偏向:
1)膠原酶I(Type I Collagenase):含有比較均勻的各種酶活力(包括膠原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶活性)。通常用作上皮細(xì)胞、肝、肺、脂肪和腎上腺組織細(xì)胞的制備;
2)膠原酶II(Type II Collagenase):含有更高的梭菌蛋白酶活性,通常用于心臟、骨、肌肉、胸腺和軟骨等組織來源細(xì)胞的制備;
3)膠原酶III(Type III Collagenase):含有較低的蛋白酶活性,常用于乳腺細(xì)胞的制備;
4)膠原酶IV(Type IV Collagenase):含有低胰酶活性,通常用于胰島細(xì)胞的制備,或者需要維持受體完整性的細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)。
本品為IV型膠原酶,≥125 CDU/mg solid(CDU = collagen digestion units),特別適用于胰島組織的消化。
使用方法
1. 膠原酶儲存液的配制
向每管100 mg的膠原酶中加入100 µL的含Ca2+、Mg2+的HBSS(Hank’s平衡鹽溶液,含Ca2+、Mg2+),輕輕旋渦震蕩使其充分溶解,制備成1g/mL(即1000×)的儲存液。然后用低蛋白結(jié)合性的0.22 μm的濾膜過濾除菌,分裝成小份量,然后于-20 °C避光凍存。
使用前于冰上解凍,避免反復(fù)凍融。其用于組織和細(xì)胞分散的常用濃度為:0.5-2.5 mg/mL,用于軟骨消化的常用濃度為1-2 mg/mL,需要根據(jù)特定的實(shí)驗(yàn)條件或者參考相應(yīng)的文獻(xiàn)資料確定所需的最佳工作濃度。
2.組織的分離
1. 使用無菌手術(shù)刀或剪刀將組織切成3-4 mm大小的組織塊;
2. 利用含Ca2+、Mg2+的HBSS洗滌組織塊數(shù)次;
3. 加入足量的含Ca2+、Mg2+的HBSS,使其浸沒組織塊,并加入膠原酶至需要工作濃度;
4. 于37℃孵育4-18 h。消化時使用水平搖床以及用3 mM的CaCl2補(bǔ)充消化可以提高消化效率。
5. 已分散開的細(xì)胞可使用不銹鋼或尼龍網(wǎng)篩篩得,收集備用。未wan全解離的組織另外添加適量的新鮮膠原酶工作液于37℃繼續(xù)孵育;
6. 利用不含膠原酶的HBSS洗滌收集的細(xì)胞數(shù)次;
7. 細(xì)胞培養(yǎng)液重懸上述細(xì)胞,利用自動細(xì)胞計(jì)數(shù)器或其他方法計(jì)算活細(xì)胞密度。
8. 于細(xì)胞培養(yǎng)皿上利用合適細(xì)胞培養(yǎng)基接種細(xì)胞。
3. 器官灌注
1. 向37℃預(yù)熱的含Ca2+、Mg2+的HBSS中加入膠原酶,另添加3 mM的CaCl2有助于提高分離效率;
2. 按照已優(yōu)化的速率對相應(yīng)的器官灌注膠原酶工作液;
3. 將上述過程中回收的灌注液流經(jīng)不銹鋼或尼龍網(wǎng)篩,從而將已解離的細(xì)胞或小片段組織塊與較大團(tuán)塊分離開來,未充分解離的組織需利用新鮮膠原酶工作液于37℃進(jìn)一步孵育;
4. 利用不含膠原酶的HBSS洗滌收集的細(xì)胞數(shù)次;
5. 細(xì)胞培養(yǎng)液重懸上述細(xì)胞,利用自動細(xì)胞計(jì)數(shù)器或其他方法計(jì)算活細(xì)胞密度。
6. 于細(xì)胞培養(yǎng)皿上利用合適細(xì)胞培養(yǎng)基接種細(xì)胞。
注意事項(xiàng)
1. 為了您的安全和健康,請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
2. 本產(chǎn)品主要用于科研領(lǐng)域,不宜用于臨床診斷或其他用途。
酶活力單位定義
在37℃,pH7.5 的條件下,5h內(nèi)水解膠原產(chǎn)生相當(dāng)于1µM L-亮氨酸的酶量定義為1個酶活力單位。
運(yùn)輸及保存條件
室溫運(yùn)輸。4℃避光保存,2年有效。儲存液-20℃避光凍存。
貨號 | 品名 | 規(guī)格 | 品牌 |
LS004186-100mg | Collagenase IV膠原酶IV型 | 100mg | BIOHUB |
LS004188-1g | Collagenase IV膠原酶IV型 | 1g | BIOHUB |
LS004189-5g | Collagenase IV膠原酶IV型 | 5g | BIOHUB |