產(chǎn)品描述
細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子導(dǎo)入真核細(xì)胞內(nèi)以改變其基因型或表型的一種技術(shù)。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展,轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制基因功能的常規(guī)手段,廣泛應(yīng)用于基因功能研究、調(diào)控基因表達(dá)、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等領(lǐng)域。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑。其中化學(xué)介導(dǎo)方法因其兼具高效低毒、方便快捷等優(yōu)點(diǎn),應(yīng)用廣泛?;瘜W(xué)介導(dǎo)方法包括經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法以及多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法。
理想的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)。已有眾多文獻(xiàn)報(bào)道,脂質(zhì)體本身會(huì)參與細(xì)胞生理活動(dòng),影響基因表達(dá),對(duì)研究數(shù)據(jù)產(chǎn)生一定程度的干擾。同時(shí),脂質(zhì)體會(huì)對(duì)目的細(xì)胞造成細(xì)胞毒性,這種毒性是由其脂質(zhì)特性決定的。市面上多種商業(yè)化的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑要求細(xì)胞鋪板密度較高,以90%-95%為佳,這有助于減少陽離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性造成的影響。但是,如果研究的基因要求比較長的表達(dá)時(shí)間,例如細(xì)胞周期相關(guān)基因,或者細(xì)胞表面蛋白,又或者轉(zhuǎn)染后續(xù)需要進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)和功能研究,則不適合用脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑。目前眾多的研究者和生物公司將新一代轉(zhuǎn)染試劑的開發(fā)聚焦在非脂質(zhì)體的聚合物上,以尋找更高效低毒,同時(shí)對(duì)研究影響較小的轉(zhuǎn)染試劑。
PolyShooterTM Transfection Reagent是一種基于陽離子高分子聚合物的新型轉(zhuǎn)染試劑,適用于DNA、RNA的轉(zhuǎn)染。其原理為帶正電的高分子聚合物與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成帶正電的復(fù)合物后,與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白多糖相互作用,并通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞,隨后在胞質(zhì)中釋放,實(shí)現(xiàn)外源核酸的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
PolyShooterTM Transfection Reagent對(duì)多種常見細(xì)胞具有高水平轉(zhuǎn)染效率,具有高效低毒、操作簡單、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。其du特的配方使其可直接加入培養(yǎng)基中,血清的存在不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率,這樣可以減少去除血清對(duì)細(xì)胞的損傷。同時(shí),轉(zhuǎn)染后不需要除去PolyShooterTM Transfection Reagent-核酸復(fù)合物或更換新鮮培養(yǎng)基,也可根據(jù)具體情況優(yōu)化轉(zhuǎn)染體系。
產(chǎn)品特點(diǎn)
2 zhuo越的轉(zhuǎn)染效率——針對(duì)廣泛類型的細(xì)胞,均表現(xiàn)出zhuo越的轉(zhuǎn)染效率和高重組蛋白表達(dá)水平
2 細(xì)胞毒性低——作用溫和,能較好地實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率與低細(xì)胞毒性之間的平衡
2 操作簡單——在血清存在時(shí)亦具有可靠的轉(zhuǎn)染效率,轉(zhuǎn)染后無需去除復(fù)合物或更換新鮮培養(yǎng)基
2 高性價(jià)比——經(jīng)濟(jì)的價(jià)格,同時(shí)實(shí)現(xiàn)高效的轉(zhuǎn)染效果
PolyShooterTM Transfection Reagent采用陽離子高分子聚合物為主要成分,適用于DNA、RNA的轉(zhuǎn)染。
使用方法使用方法
(以24孔板為例,其他培養(yǎng)板加樣體積參考表一:轉(zhuǎn)染量度標(biāo)準(zhǔn))
1: 準(zhǔn)備待轉(zhuǎn)染細(xì)胞
貼壁細(xì)胞:轉(zhuǎn)染前一天,將胰酶消化后的細(xì)胞按照每孔0.5-1.5x105個(gè)細(xì)胞的量進(jìn)行鋪板,使其在轉(zhuǎn)染時(shí)密度為50%左右。
懸浮細(xì)胞:轉(zhuǎn)染當(dāng)天,配制轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物之前,在24孔板中進(jìn)行細(xì)胞鋪板,每500 µL生長培養(yǎng)基中加入1-3x105個(gè)細(xì)胞。
? 細(xì)胞狀態(tài)會(huì)極大影響轉(zhuǎn)染效率,待轉(zhuǎn)染細(xì)胞應(yīng)處于良好生長狀態(tài),建議使用生長處于指數(shù)期、存活率大于90% 的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
2: 準(zhǔn)備PolyShooterTM轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物
(1)取1 μg質(zhì)粒加入到1.5 mL離心管中,加入2.5 μL* PolyShooterTM 轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)?;旌?,室溫孵育3分鐘。
? * 轉(zhuǎn)染試劑使用量受細(xì)胞類型及其他實(shí)驗(yàn)條件影響,通常情況下,DNA(μg)和 PolyShooterTM轉(zhuǎn)染試劑(μL)的用量比例為1:2.5。建議初次使用時(shí),可在1:2-1:5的范圍內(nèi)調(diào)整以優(yōu)化轉(zhuǎn)染效果。
(2)往上述混合物中加入100 μL無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基(與培養(yǎng)體系一致,且無血清無雙抗),輕輕混勻,在室溫下靜置30分鐘,形成PolyShooterTM轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。
? PolyShooterTM轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物在室溫下4個(gè)小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。
3: 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
給細(xì)胞更換新鮮的預(yù)熱的wan全培養(yǎng)基500 μL/孔,將上述100 µL PolyShooterTM 轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物加入每孔細(xì)胞,輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板混勻。
? 對(duì)于懸浮細(xì)胞系:轉(zhuǎn)染5小時(shí)后,可選擇加入PMA和/或PHA以提高CVM啟動(dòng)子的活性并促進(jìn)基因表達(dá)。對(duì)于Jurkat細(xì)胞,PHA和PMA的終濃度分別為1 µg/mL和50 ng/mL,可以提高CMV啟動(dòng)子活性和基因表達(dá)。對(duì)于K562細(xì)胞,只加入PMA足以提高啟動(dòng)子活性。
4. 分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞
轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)24-48小時(shí)后,可根據(jù)實(shí)際情況用熒光檢測法、Western Blot、RT-PCR、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、報(bào)告基因等檢測轉(zhuǎn)染效果,或加入篩選藥物進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選。
表一:轉(zhuǎn)染量度標(biāo)準(zhǔn)
細(xì)胞培養(yǎng)裝置 | 生長培養(yǎng)基 體積 (mL) | 質(zhì)粒 (μg) | PolyShooterTM轉(zhuǎn)染試劑 (μL) | 無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基體積(μL) |
96孔板 | 0.1 | 0.2 | 0.5 | 20 |
24孔板 | 0.5 | 1 | 2.5 | 100 |
12孔板 | 1 | 2 | 5 | 200 |
6孔板 | 2 | 2-4 | 5-10 | 400 |
60 mm培養(yǎng)皿 | 4 | 3-5 | 7.5-12.5 | 800 |
100 mm培養(yǎng)皿 | 10 | 5-10 | 12.5-25 | 2000 |
125 mL搖瓶 | 30-35 | 30-35 | 75-87.5 | 6000 |
500 mL搖瓶 | 120-140 | 120-140 | 300-350 | 24000 |
1000 mL搖瓶 | 240-280 | 240-280 | 600-700 | 48000 |
實(shí)驗(yàn)案例分析
09/實(shí)驗(yàn)案例分析
1: 轉(zhuǎn)染前一天,將圖2所示9種狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于24孔板,使其在轉(zhuǎn)染時(shí)密度約為50%。
2: 按照每孔計(jì)量,取1μg GFP質(zhì)粒加入到1.5 mL離心管中,加入2.5 μL PolyShooterTM Transfection Reagent與質(zhì)?;旌希覝胤跤?/span>3 min后,往混合物
加入100 μL無血清基礎(chǔ)DMEM培養(yǎng)基,輕輕混勻,在室溫下靜置30 min,形成PolyShooterTM轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。
3: 給細(xì)胞更換新鮮的預(yù)熱的wan全培養(yǎng)基500 μL/孔,將上述100 µL PolyShooterTM 轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物加入每孔細(xì)胞,輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板混勻。
4:轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后,用熒光顯微鏡檢測GFP綠色熒光蛋白表達(dá)情況,并拍照記錄,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。
圖2: 轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后,用熒光顯微鏡檢測GFP綠色熒光蛋白表達(dá)情況
注意事項(xiàng)
1. 核酸質(zhì)量:想要獲得最高的轉(zhuǎn)染效率和最di的細(xì)胞毒性,應(yīng)選用高純度、無菌、無污染、無內(nèi)毒素的優(yōu)質(zhì)核酸。質(zhì)粒中的內(nèi)毒素是轉(zhuǎn)染的大敵,內(nèi)毒素會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率顯著下降,特別是對(duì)內(nèi)毒素敏感的細(xì)胞,例如原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞、造血細(xì)胞等。推薦使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取,保證質(zhì)粒A260/A280比值為1.8-2.0。同時(shí),需合理計(jì)算質(zhì)粒用量,轉(zhuǎn)染過量的質(zhì)??赡?/span>會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性甚至死亡;
2. 細(xì)胞質(zhì)量:細(xì)胞狀態(tài)會(huì)極大影響轉(zhuǎn)染效率,建議使用生長處于指數(shù)期、存活率大于90%的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染;
3. 細(xì)胞密度:建議細(xì)胞傳代后12-24 h內(nèi)、細(xì)胞密度約為50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。不同的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),對(duì)細(xì)胞密度的要求不盡相同。在進(jìn)行不同核酸或不同細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染時(shí),需要根據(jù)說明書再次優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。此外,在實(shí)驗(yàn)過程中保證相同的接種條件,確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可重復(fù)性;
4. 質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑使用比例:對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞系,轉(zhuǎn)染復(fù)合物中DNA (μg)與PolyShooterTM Transfection Reagent (μL) 的比例在1:2至1:5之間,推薦比例為1:2.5。想要獲得好的轉(zhuǎn)染結(jié)果,需要對(duì)這一比例進(jìn)行優(yōu)化,根據(jù)所轉(zhuǎn)染細(xì)胞及質(zhì)粒選擇適合的轉(zhuǎn)染比例;
5. PolyShooterTM Transfection Reagent可用于有血清培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)染,并且轉(zhuǎn)染前后不需要換培養(yǎng)基。但是,制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物時(shí)要求用無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑,因?yàn)檠鍟?huì)影響復(fù)合物的形成;
6. 由于一些特殊培養(yǎng)基中的某些成分可能會(huì)抑制陽離子聚合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染,因此有必要檢測特殊培養(yǎng)基與PolyShooterTM Transfection Reagent的相容性;
7. 為了您的健康安全,請(qǐng)規(guī)范操作,穿戴實(shí)驗(yàn)服與手套開展實(shí)驗(yàn);
8. 本產(chǎn)品僅供科研使用,請(qǐng)勿用于臨床診斷及治療。
運(yùn)輸及保存方法
冰袋(wet ice)運(yùn)輸。4℃保存,有效期6個(gè)月。-30℃至-10℃保存,有效期12個(gè)月,避免反復(fù)凍融。
貨號(hào) | 品名 | 規(guī)格 | 品牌 |
78EF10004-1ml | POLYPEI轉(zhuǎn)染試劑 | 1ml | BIOHUB |
8EF10004-5ml | POLYPEI轉(zhuǎn)染試劑 | 5ml | BIOHUB |