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Femto ECL 特超敏發(fā)光液說明書

更新時間:2023-10-24      點(diǎn)擊次數(shù):152

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產(chǎn)品描述

Femto ECL 是一款具有特超高靈敏度的增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)底物,也是我們ECL發(fā)光液中的靈敏度非常好的化學(xué)發(fā)光底物,由于采用了核心技術(shù)基于“熒光震蕩"機(jī)理設(shè)計(jì)的發(fā)光底物系統(tǒng)。可通HRP實(shí)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)低飛克級(以HRP濃度為準(zhǔn))的免疫印跡檢測,其靈敏度,發(fā)光時間和背景均明顯優(yōu)秀。

產(chǎn)品特點(diǎn)
  1. 靈敏—使用適當(dāng)?shù)囊豢购投箷r,可在硝化纖維膜或PVDF膜上檢測豐度為飛克級的蛋白條帶

  2. 定量—所得信號的可定量檢測范圍跨越兩個數(shù)量級

  3. 明亮信號—通過膠片或成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光,易于捕獲圖像

  4. 長信號持續(xù)時間—優(yōu)化條件下,可檢測的光信號輸出長達(dá)8小時

  5. 穩(wěn)定試劑—試劑盒組分能夠在4°C條件下穩(wěn)定放置一年,在室溫下可穩(wěn)定放置6個月

  6. 價格經(jīng)濟(jì)— 配方經(jīng)過優(yōu)化,可適用于濃度極低的抗體檢測

  7. 1ng至0.2 µg/mL一抗(以1 µg/mL儲存液稀釋1:5,000至1:100,000倍)

  8. 2ng至10 ng/mL二抗(以1 µg/mL儲存液稀釋1:100,000至1:500,000倍)

  9. 當(dāng)Femto ECL底物與優(yōu)化的抗體濃度和封閉緩沖液配合使用時,可檢測到常規(guī)ECL底物無法檢測的低豐度靶標(biāo)蛋白。

使用方法
使用方法

其他所需材料

  • 已完成轉(zhuǎn)印的印跡膜:用合適的電泳法分離蛋白質(zhì),并將這些蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。

  • 稀釋緩沖液:使用Tris或磷酸鹽緩沖液。

  • 洗滌緩沖液:將5mL 10%的Tween-20加入1000mL稀釋緩沖液(Tween-20的終濃度將0.05%)。

  • 封閉試劑:將0.5mL10%的Tween-20加入100mL的封閉緩沖液,選擇一種與稀釋緩沖液具有相同基本組分的封閉緩沖液。

  • 一抗: 選擇一種目標(biāo)蛋白質(zhì)特異性抗體。使用稀釋緩沖液制備該抗體的儲存液。使用封閉試劑將抗體從儲備液稀釋成抗體工作液。最佳稀釋度取決于一抗和膜上的抗原量。

  • HRP標(biāo)記的二抗:選擇一種與二抗特異性結(jié)合的HRP標(biāo)記二抗,使用稀釋緩沖液制備該抗體的儲存液。使用封閉試劑將抗體從儲備液稀釋成抗體工作液。稀釋度介于1:100000和1:500000之間或抗體工作液濃度為2~10ng/ml。該濃度范圍在使用鏈親和素-HRP時也適用。二抗的最佳稀釋度取決于HRP標(biāo)記二抗和膜上的抗原量。

  • 用于處理放射顯影膠片的膠片暗盒、顯影和定影試劑

  • 用于孵育的旋轉(zhuǎn)搖床。

蛋白印跡法詳細(xì)操作步驟

1) 將印記膜從蛋白轉(zhuǎn)印設(shè)備中取出,加入合適的封閉液在溫室下孵育20-60分鐘,同時振蕩。以封閉膜上非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)。請注意:使用在前文建議的抗體稀釋度是非常重要的。

2) 將膜從封閉液中取出,與一抗工作液在溫室孵育1小時,同時振蕩;或在28℃孵育過夜,不振蕩。

3) 將足量的洗滌緩沖液加至膜上,保證緩沖液將膜wan全覆蓋。振蕩孵育≥5分鐘,更換洗滌緩沖液并重復(fù)該步驟4-6次。增加洗滌緩沖液體積,洗滌次數(shù)和洗滌時間有助于降低背景信號。

注:孵育前,膜在洗滌緩沖液中的短暫淋洗會提高洗滌效率。

請注意:使用在前文建議的HRP標(biāo)記二抗稀釋度是非常重要的。

4) 將HRP標(biāo)記的二抗工作液與膜在溫室孵育1小時,同時振蕩。

5) 重復(fù)步驟3,以除去未結(jié)合的HRP標(biāo)記二抗。注:膜與HRP標(biāo)記二抗孵育后必須進(jìn)行徹di洗滌。

6) 將A溶液與B液等比例混合,制備成工作液。每cm2膜使用0.01~0.1ml工作液。工作液可以在溫室下穩(wěn)定8小時。注:暴漏雨日光或任何其他強(qiáng)光下可能損害工作液,為獲得最佳結(jié)果,將此工作液保存在琥珀色瓶中,并避免長期暴漏雨任何強(qiáng)光。實(shí)驗(yàn)室的常見照明不會損害工作液。

7) 將印記膜在工作液中孵育5分鐘。

8) 從工作液中取出印記膜,并置于一個塑料片或清潔的塑料紙(膜)中,用一張吸水紙吸除多余的液體,并從印記和塑料紙之間小心地壓出氣泡。

9) 將包在塑料紙(膜)中的印記膜置于膠片暗盒中,蛋白質(zhì)面朝上,除適用于膠片曝光的燈(如紅色安全燈)之外,關(guān)閉所有的燈。

注;膠片必須在曝光期間保持干燥,為獲得最佳效果,采取以下措施:

*   確保將多余的底物從膜和塑料紙上wan全去除。

*   在整個膠片處理期間,使用手套。

*   切莫將印記膜置于已顯影的膠片上,因?yàn)槟z片上的化學(xué)物質(zhì)會減弱信號。

10) 將X光膠片置于膜的上面。建議第一次曝光60秒。之后可調(diào)整曝光時間以達(dá)到最佳結(jié)果?;瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)在底物孵育后的前5-30分鐘期間是zui強(qiáng)烈的。這一反應(yīng)可以持續(xù)幾個小時,但強(qiáng)度會隨時間下降,如有底物孵育后較長時間后曝光,曝光時間可能需要延長以獲得較強(qiáng)信號。如果使用磷光存儲成像設(shè)備(如Bio-Rad的分子成像儀系統(tǒng))或CCD照相機(jī)可能需要較長的曝光時間。

   警告:膠片與膜之間的任何移動可能在膠片上造成人為的非特異信號。

11) 使用合適的顯影劑和定影劑對膠片進(jìn)行顯影。如果信號太強(qiáng),則縮短曝光時間或?qū)⒂∮浤みM(jìn)行剝離并降低抗體濃度重新檢測。

常見問題及解決方案


問題

可能問題

解決方案

膠片上有反轉(zhuǎn)像(即黑色背景,白色帶)

系統(tǒng)中HRP過多

將HRP標(biāo)記二抗稀釋至少10倍

膜上有褐色或黃色帶

印記在暗室中發(fā)光

信號持續(xù)時間少于8小時

信號弱或無信號

系統(tǒng)中過多的HRP耗盡了底物并導(dǎo)致信號迅速衰減

將HRP標(biāo)記二抗稀釋至少10倍

抗原或抗體的量不足

增加抗體或抗原的量

蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移率低

優(yōu)化轉(zhuǎn)印

HRP或底物活性低

見下文注釋

高背景

系統(tǒng)中HRP過多

將HRP標(biāo)記二抗稀釋至少10倍

封閉不充分

優(yōu)化封閉條件

封閉式機(jī)不合適

嘗試一種不同的封閉試劑

洗滌不充分

增加洗滌時間、次數(shù)或洗滌緩沖液體積

膠片過度曝光

縮短曝光時間或使用背景消除劑

抗原或抗體的濃度太高

減少抗體或抗原的量

蛋白質(zhì)條內(nèi)有斑點(diǎn)

蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜效率低

優(yōu)化轉(zhuǎn)印流程

膜的水化不均勻

按照制造商建議適度的使膜水化

膠片與膜之間存在氣泡

在膠片曝光前,去除氣泡

膠片上背景有斑點(diǎn)

HRP標(biāo)記二抗中存在聚集物

使用0.2um的過濾器

非特異性條帶

系統(tǒng)中HRP過多

將HRP標(biāo)記二抗稀釋至少10倍。

SDS導(dǎo)致的蛋白非特異性結(jié)合

在檢測過程中不使用SDS




































*為檢測系統(tǒng)活性,在暗室中,在一個清潔試管中制備1-2ml底物工作液。關(guān)閉燈,添加1ul未稀釋的HRP標(biāo)記二抗工作液。該溶液應(yīng)當(dāng)立即發(fā)出藍(lán)色光,藍(lán)光信號在隨后的幾分鐘漸淡。

注意事項(xiàng)
注:優(yōu)化抗原和抗體的濃度。必須使用建議的抗體稀釋度,以保證陽性結(jié)果。有關(guān)建議的稀釋度范圍請參考其他所需材料。
1)  將一抗?jié)舛认♂尩?ng至0.2 ng/mL(以1 µg/mL儲存液稀釋1:5,000至1:100,000倍)
2) 將二抗?jié)舛认♂尩?ng至10 ng/mL(以1 µg/mL儲存液稀釋1:100,000至1:500,000倍)
3) 將兩種底物組份按1:1比例混合,制備底物工作液。
注:暴漏于日光或任何其他強(qiáng)光可能損害工作液,為獲得最佳結(jié)果,將此工作液保存在琥珀色瓶中,并避免長期暴漏于任何強(qiáng)光。短時間暴漏于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)照明不會損害該工作液。
4) 將印跡膜在 Femto ECL底物工作液中孵育5分鐘。
5) 吸出多余試劑。用清潔的塑料膜蓋住該印跡膜。
6)  使印跡膜在X光膠片上曝光。


貨號品名規(guī)格品牌
78CI10002-10mlFemto ECL 特超敏發(fā)光液10mlBIOHUB
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