Femto ECL 是一款具有特超高靈敏度的增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)底物,也是我們ECL發(fā)光液中的靈敏度非常好的化學(xué)發(fā)光底物,由于采用了核心技術(shù)基于“熒光震蕩"機(jī)理設(shè)計(jì)的發(fā)光底物系統(tǒng)。可通HRP實(shí)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)低飛克級(以HRP濃度為準(zhǔn))的免疫印跡檢測,其靈敏度,發(fā)光時間和背景均明顯優(yōu)秀。
靈敏—使用適當(dāng)?shù)囊豢购投箷r,可在硝化纖維膜或PVDF膜上檢測豐度為飛克級的蛋白條帶
定量—所得信號的可定量檢測范圍跨越兩個數(shù)量級
明亮信號—通過膠片或成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光,易于捕獲圖像
長信號持續(xù)時間—優(yōu)化條件下,可檢測的光信號輸出長達(dá)8小時
穩(wěn)定試劑—試劑盒組分能夠在4°C條件下穩(wěn)定放置一年,在室溫下可穩(wěn)定放置6個月
價格經(jīng)濟(jì)— 配方經(jīng)過優(yōu)化,可適用于濃度極低的抗體檢測
1ng至0.2 µg/mL一抗(以1 µg/mL儲存液稀釋1:5,000至1:100,000倍)
2ng至10 ng/mL二抗(以1 µg/mL儲存液稀釋1:100,000至1:500,000倍)
當(dāng)Femto ECL底物與優(yōu)化的抗體濃度和封閉緩沖液配合使用時,可檢測到常規(guī)ECL底物無法檢測的低豐度靶標(biāo)蛋白。
其他所需材料
已完成轉(zhuǎn)印的印跡膜:用合適的電泳法分離蛋白質(zhì),并將這些蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。
稀釋緩沖液:使用Tris或磷酸鹽緩沖液。
洗滌緩沖液:將5mL 10%的Tween-20加入1000mL稀釋緩沖液(Tween-20的終濃度將0.05%)。
封閉試劑:將0.5mL10%的Tween-20加入100mL的封閉緩沖液,選擇一種與稀釋緩沖液具有相同基本組分的封閉緩沖液。
一抗: 選擇一種目標(biāo)蛋白質(zhì)特異性抗體。使用稀釋緩沖液制備該抗體的儲存液。使用封閉試劑將抗體從儲備液稀釋成抗體工作液。最佳稀釋度取決于一抗和膜上的抗原量。
HRP標(biāo)記的二抗:選擇一種與二抗特異性結(jié)合的HRP標(biāo)記二抗,使用稀釋緩沖液制備該抗體的儲存液。使用封閉試劑將抗體從儲備液稀釋成抗體工作液。稀釋度介于1:100000和1:500000之間或抗體工作液濃度為2~10ng/ml。該濃度范圍在使用鏈親和素-HRP時也適用。二抗的最佳稀釋度取決于HRP標(biāo)記二抗和膜上的抗原量。
用于處理放射顯影膠片的膠片暗盒、顯影和定影試劑
用于孵育的旋轉(zhuǎn)搖床。
蛋白印跡法詳細(xì)操作步驟
1) 將印記膜從蛋白轉(zhuǎn)印設(shè)備中取出,加入合適的封閉液在溫室下孵育20-60分鐘,同時振蕩。以封閉膜上非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)。請注意:使用在前文建議的抗體稀釋度是非常重要的。
2) 將膜從封閉液中取出,與一抗工作液在溫室孵育1小時,同時振蕩;或在28℃孵育過夜,不振蕩。
3) 將足量的洗滌緩沖液加至膜上,保證緩沖液將膜wan全覆蓋。振蕩孵育≥5分鐘,更換洗滌緩沖液并重復(fù)該步驟4-6次。增加洗滌緩沖液體積,洗滌次數(shù)和洗滌時間有助于降低背景信號。
注:孵育前,膜在洗滌緩沖液中的短暫淋洗會提高洗滌效率。
請注意:使用在前文建議的HRP標(biāo)記二抗稀釋度是非常重要的。
4) 將HRP標(biāo)記的二抗工作液與膜在溫室孵育1小時,同時振蕩。
5) 重復(fù)步驟3,以除去未結(jié)合的HRP標(biāo)記二抗。注:膜與HRP標(biāo)記二抗孵育后必須進(jìn)行徹di洗滌。
6) 將A溶液與B液等比例混合,制備成工作液。每cm2膜使用0.01~0.1ml工作液。工作液可以在溫室下穩(wěn)定8小時。注:暴漏雨日光或任何其他強(qiáng)光下可能損害工作液,為獲得最佳結(jié)果,將此工作液保存在琥珀色瓶中,并避免長期暴漏雨任何強(qiáng)光。實(shí)驗(yàn)室的常見照明不會損害工作液。
7) 將印記膜在工作液中孵育5分鐘。
8) 從工作液中取出印記膜,并置于一個塑料片或清潔的塑料紙(膜)中,用一張吸水紙吸除多余的液體,并從印記和塑料紙之間小心地壓出氣泡。
9) 將包在塑料紙(膜)中的印記膜置于膠片暗盒中,蛋白質(zhì)面朝上,除適用于膠片曝光的燈(如紅色安全燈)之外,關(guān)閉所有的燈。
注;膠片必須在曝光期間保持干燥,為獲得最佳效果,采取以下措施:
* 確保將多余的底物從膜和塑料紙上wan全去除。
* 在整個膠片處理期間,使用手套。
* 切莫將印記膜置于已顯影的膠片上,因?yàn)槟z片上的化學(xué)物質(zhì)會減弱信號。
10) 將X光膠片置于膜的上面。建議第一次曝光60秒。之后可調(diào)整曝光時間以達(dá)到最佳結(jié)果?;瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)在底物孵育后的前5-30分鐘期間是zui強(qiáng)烈的。這一反應(yīng)可以持續(xù)幾個小時,但強(qiáng)度會隨時間下降,如有底物孵育后較長時間后曝光,曝光時間可能需要延長以獲得較強(qiáng)信號。如果使用磷光存儲成像設(shè)備(如Bio-Rad的分子成像儀系統(tǒng))或CCD照相機(jī)可能需要較長的曝光時間。
警告:膠片與膜之間的任何移動可能在膠片上造成人為的非特異信號。
11) 使用合適的顯影劑和定影劑對膠片進(jìn)行顯影。如果信號太強(qiáng),則縮短曝光時間或?qū)⒂∮浤みM(jìn)行剝離并降低抗體濃度重新檢測。
常見問題及解決方案
問題 | 可能問題 | 解決方案 |
膠片上有反轉(zhuǎn)像(即黑色背景,白色帶) |
系統(tǒng)中HRP過多 |
將HRP標(biāo)記二抗稀釋至少10倍 |
膜上有褐色或黃色帶 | ||
印記在暗室中發(fā)光 | ||
信號持續(xù)時間少于8小時 | ||
信號弱或無信號 | 系統(tǒng)中過多的HRP耗盡了底物并導(dǎo)致信號迅速衰減 | 將HRP標(biāo)記二抗稀釋至少10倍 |
抗原或抗體的量不足 | 增加抗體或抗原的量 | |
蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移率低 | 優(yōu)化轉(zhuǎn)印 | |
HRP或底物活性低 | 見下文注釋 | |
高背景 | 系統(tǒng)中HRP過多 | 將HRP標(biāo)記二抗稀釋至少10倍 |
封閉不充分 | 優(yōu)化封閉條件 | |
封閉式機(jī)不合適 | 嘗試一種不同的封閉試劑 | |
洗滌不充分 | 增加洗滌時間、次數(shù)或洗滌緩沖液體積 | |
膠片過度曝光 | 縮短曝光時間或使用背景消除劑 | |
抗原或抗體的濃度太高 | 減少抗體或抗原的量 | |
蛋白質(zhì)條內(nèi)有斑點(diǎn) | 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜效率低 | 優(yōu)化轉(zhuǎn)印流程 |
膜的水化不均勻 | 按照制造商建議適度的使膜水化 | |
膠片與膜之間存在氣泡 | 在膠片曝光前,去除氣泡 | |
膠片上背景有斑點(diǎn) | HRP標(biāo)記二抗中存在聚集物 | 使用0.2um的過濾器 |
非特異性條帶 | 系統(tǒng)中HRP過多 | 將HRP標(biāo)記二抗稀釋至少10倍。 |
SDS導(dǎo)致的蛋白非特異性結(jié)合 | 在檢測過程中不使用SDS |
*為檢測系統(tǒng)活性,在暗室中,在一個清潔試管中制備1-2ml底物工作液。關(guān)閉燈,添加1ul未稀釋的HRP標(biāo)記二抗工作液。該溶液應(yīng)當(dāng)立即發(fā)出藍(lán)色光,藍(lán)光信號在隨后的幾分鐘漸淡。
貨號 | 品名 | 規(guī)格 | 品牌 |
78CI10002-10ml | Femto ECL 特超敏發(fā)光液 | 10ml | BIOHUB |
78CI10002-100ml | Femto ECL 特超敏發(fā)光液 | 100ml | BIOHUB |
78CI10002-500ml | Femto ECL 特超敏發(fā)光液 | 500ml | BIOHUB |