牛痘病毒加帽酶 (10 KU/mL)說明書
真核生物中mRNA經(jīng)轉(zhuǎn)錄后修飾在5'端形成一個特殊結(jié)構(gòu),即帽子結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)對mRNA的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運與翻譯過程均有較重要作用。牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子結(jié)構(gòu)的有效酶,其由D1和D12兩個亞基組成,兼具RNA三磷酸酯酶活性、鳥苷?;D(zhuǎn)移酶活性和鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶活性,可將7-甲基鳥嘌呤帽結(jié)構(gòu)(m7Gppp)連接到RNA的5'末端(m7Gppp5'N)。牛痘病毒加帽酶,在合適濃度的加帽緩沖液(Capping buffer),鳥苷三磷酸(GTP),S-腺苷甲硫氨酸(SAM)等存在條件下,能夠在一個小時之內(nèi)對RNA進行加帽,并且保證正確的方向。
本品以無菌液體形式提供,可應(yīng)用于體內(nèi)/體外翻譯前mRNA的加帽反應(yīng)或mRNA的5'末端標記反應(yīng)。
產(chǎn)品組分
組分名稱 | 產(chǎn)品編碼/規(guī)格 | ||
78MRNA-1105A(500 U) | 78MRNA-1105B(2000 U) | 78MRNA-1105C(10000 U) | |
10×Capping Buffer | 150 ul | 500 ul | 1.25 mL×2 |
SAM(32mM) | 50 ul | 200 ul | 1 ml |
RNase free water | 1ml | 1ml | 1mlx3 |
Vaccinia Virus Capping Enzyme (10 U/μL) | 50 ul | 200 ul | 1 mL |
產(chǎn)品性質(zhì)
來源(Source) | 攜帶牛痘病毒加帽酶基因的E. coli |
最適溫度(Optimum Temperature) | 37℃ |
儲存緩沖液(Storage Buffer) | 20 mM Tris-HCl pH 8.0,100 mM NaCl,1 mM DTT,0.1 mM EDTA,0.1% Triton X-100,50%甘油 |
活性單位定義(Unit Definition) | 37℃條件下,1小時內(nèi)將10 pmol GTP(α- 32P)摻入到一條含80個核苷酸(80 nt)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上所需要的酶量,即為1個單位。 |
產(chǎn)品應(yīng)用【 加帽反應(yīng) 】適用于10 μg RNA(≥100 nt)的加帽反應(yīng),反應(yīng)體系20 μL,且可根據(jù)實驗需要放大。1. 取10 μg RNA,用RNase free water將適量RNA稀釋至15 μL;2. 將RNA置于65℃加熱5 min,結(jié)束后冰上放置5 min;3. 按照右側(cè)表格依次加入各組分;4. 37℃反應(yīng)30 min;5. RNA加帽完成,可進行后續(xù)實驗。
組分 | 體積 |
Denatured RNA | 15 ul |
10×Capping Reaction Buffer | 2 ul |
GTP (10 mM) | 1 ul |
SAM (2 mM) | 1 ul |
Vaccinia Capping Enzyme (10 U/μL) | 1 ul |
Total volume | 20ul |
【 5′ 末端標記反應(yīng) 】本步驟適用于 5′末端帶有三磷酸的RNA標記,且可根據(jù)實驗需要放大。其標記效率受反應(yīng)體系中RNA與GTP摩爾濃度比以及RNA樣本中GTP含量影響。1. 用RNase Free Water將適量RNA稀釋至14 μL;2. 將RNA置于65℃加熱5 min,結(jié)束后冰上放置5 min;3. 按照右側(cè)表格依次加入各組分;4. 37℃孵育30 min;5. RNA 5′末端標記完成,可進行后續(xù)實驗。
組分 | 體積 |
Denatured RNA | 14 ul |
10×Capping Reaction Buffer | 2 ul |
GTP Mix | 2 ul |
SAM (2 mM) | 1 ul |
Vaccinia Capping Enzyme (10 U/μL) | 1 ul |
Total volume | 20 ul |
*注:GTP Mix為GTP和少量標記物,GTP儲液應(yīng)稀釋為反應(yīng)體系中mRNA摩爾濃度的1~3倍。 注意事項:(1)用于加帽反應(yīng)的RNA在使用前應(yīng)進行純化并溶解于RNase free water 。溶液中不能含有EDTA和鹽。(2)加帽酶反應(yīng)前加熱RNA可以去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5′的二級結(jié)構(gòu)。如果轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5′端結(jié)構(gòu)復雜,可將加熱時間延長至10 min。(3)如果轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5′端結(jié)構(gòu)復雜,為提高加帽效率可將反應(yīng)時間延長至120 min。(4)SAM在室溫下會逐漸降解,SAM降解會導致N 7 甲基化效率降低,會進一步導致加帽失敗,因此需始終放置在冰上。此外,也可以通過體系優(yōu)化適當提高用量以保證加帽反應(yīng)順利進行。 其他用途可參考上述用途或相關(guān)文獻資料進行實驗
運輸和保存方法
干冰運輸。-20 oC保存,避免反復凍融,有效期1年。
注意事項
1. 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作;
2. 所提取的RNA需經(jīng)過純化并使用無核酸酶的水重懸;
3. 在加入酶之前需要對RNA溶液進行加熱以去除5'末端的二級結(jié)構(gòu);
4. 對于已知5'末端結(jié)構(gòu)的RNA,可以延長反應(yīng)時間至60分鐘,提高加帽效率;
5. 5'末端標記反應(yīng)體系中,GTP儲液應(yīng)稀釋為反應(yīng)體系中mRNA摩爾濃度的1-3倍。
貨號 | 品名 | 規(guī)格 | 品牌 |
78MRNA-1105A | 牛痘病毒加帽酶 (10 KU/mL) | 500 U | BIOHUB |
78MRNA-1105B | 牛痘病毒加帽酶 (10 KU/mL) | 2000 U | BIOHUB |
78MRNA-1105C | 牛痘病毒加帽酶 (10 KU/mL) | 10000 U | BIOHUB |