488 Caspase-3活細(xì)胞分析試劑盒說明書
活細(xì)胞分析試劑盒包含 488 Caspase-3底物和Ac-DEVD-CHO Caspase-3/7抑制劑。 488 Caspase-3 Substrate為基于Caspase-3/7活力檢測(cè)細(xì)胞凋亡提供了有效的工具,適用于熒光顯微觀察和流式細(xì)胞儀分析。
相較于其它基于(FLICA)分析的 Caspase 的熒光底物或熒光抑制,試劑盒內(nèi)提供的Substrate 檢測(cè)Caspase-3/7 活性的同時(shí)不會(huì)抑制完整細(xì)胞的凋亡過程。Substrate由耦合Caspase-3/7 DEVD識(shí)別序列的熒光DNA染料組成。Substrate 最初無熒光,其會(huì)穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。在凋亡細(xì)胞中Caspase-3/7剪切Substrate釋放高親和性的DNA 染料,這種染料遷移到細(xì)胞核標(biāo)記DNA 并發(fā)出明亮的綠色熒光。Substrate 是雙功能的,既可以檢測(cè) Caspase-3/7 活性,又能可視化細(xì)胞核在細(xì)胞凋亡進(jìn)行中的形態(tài)學(xué)變化。
1. 實(shí)驗(yàn)優(yōu)化
下面提供的實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)終點(diǎn)法檢測(cè)制度。488 Substrate 可進(jìn)行細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間孵育過程研究。細(xì)胞密度、底物濃度和抑制劑濃度可能需要優(yōu)化。推薦底物濃度1-10 μM之間。細(xì)胞可在培養(yǎng)基、PBS或其他的緩沖液中孵育底物。對(duì)于貼壁細(xì)胞,建議更換新鮮含有底物的培養(yǎng)基,以防背景的不均一性。底物孵育后換液或洗滌細(xì)胞等操作可自由選擇。
2. 對(duì)照設(shè)定
推薦設(shè)定以下對(duì)照:
A. 陰性對(duì)照:不誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞
B. 陽(yáng)性對(duì)照:誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞
C. 抑制劑對(duì)照:誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡同時(shí)(或提qian10-30 min)孵育Caspase-3/7抑制劑,最后再添加 488 Caspase-3底物。
3. 抑制劑對(duì)照
試劑盒中所提供的Caspase-3/7 抑制劑 Ac-DEVD-CHO 可用來確認(rèn)Caspase-3/7 依賴于 488 的熒光信號(hào)。對(duì)于抑制劑對(duì)照,抑制劑的終濃度應(yīng)至少是底物濃度的2倍(例如當(dāng)使用5 μM 488 底物時(shí),Ac-DEVD-CHO濃度為 10 μM)。添加底物前在室溫下孵育Ac-DEVD-CHO 15-30 min,加入底物后,孵育液中繼續(xù)保留抑制劑。Ac-DEVD-CHO 是可逆的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。對(duì)于某些細(xì)胞類型有效的Caspase-3/7 抑制劑需要使用不可逆的抑制劑,如Z-DEVD-FMK,或需要在凋亡誘導(dǎo)之前或誘導(dǎo)過程中添加抑制劑。
4. 流式細(xì)胞儀分析
4.1 選擇合適的方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,未經(jīng)處理的細(xì)胞樣本作為對(duì)照。
4.2 對(duì)于貼壁細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)前先用胰蛋白酶或其他方法消化細(xì)胞。
4.3 用細(xì)胞培養(yǎng)基或合適緩沖液重懸細(xì)胞,使細(xì)胞密度達(dá)到106個(gè)/mL數(shù)量級(jí)。
4.4 添加200 μL 細(xì)胞懸液至流式細(xì)胞試管。
4.5 抑制劑對(duì)照樣本,用Ac-DEVD-CHO 處理細(xì)胞(見上文)。
4.6 200 μL細(xì)胞懸液中加5 μL 0.2 mM 的Substrate并立即混勻使底物濃度為5 μM。不同類型細(xì)胞最佳底物濃度可能不同,需進(jìn)一步優(yōu)化。
4.7 室溫避光孵育15-30 min。
4.8 加入300 μL細(xì)胞培養(yǎng)基或PBS,使用流式細(xì)胞儀分析,選擇檢測(cè)綠色熒光的通道(激發(fā)/發(fā)射:485/515 nm)。
5. 熒光顯微鏡觀察
5.1 選擇合適的方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,未經(jīng)處理的細(xì)胞樣本作為對(duì)照。
5.2 抑制劑對(duì)照樣本,用Ac-DEVD-CHO 處理細(xì)胞(見上文)。
5.3 用含5 μM Substrate 的新鮮培養(yǎng)基或PBS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液(見試驗(yàn)優(yōu)化)。對(duì)于抑制劑對(duì)照組,抑制劑與底物一同孵育。
5.4 室溫孵育30 min 或更長(zhǎng)時(shí)間。
5.5 PBS或其它緩存液清洗細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞,使用觀察綠色熒光的濾片(激發(fā)/發(fā)射:485/515 nm)。
6. 熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)
6.1 將貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)在黑色96孔板中;對(duì)于懸浮細(xì)胞,調(diào)整密度至106個(gè)/mL,每孔加入0.2 mL細(xì)胞懸液。
6.2 選擇合適的方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,未經(jīng)處理的細(xì)胞樣本作為對(duì)照。(注意:細(xì)胞可能在管或瓶中處理,然后轉(zhuǎn)移到 96孔檢測(cè)板。)
6.3 抑制劑對(duì)照樣本,用 Ac-DEVD-CHO 處理細(xì)胞(見上文)。
6.4 對(duì)于懸浮細(xì)胞,直接添加Substrate 混勻。對(duì)于貼壁細(xì)胞,用含有5 μM Substrate的新鮮培養(yǎng)基或PBS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液(見試驗(yàn)優(yōu)化)。對(duì)于抑制劑對(duì)照組,抑制劑與底物一同孵育。
6.5 細(xì)胞可以在含有Substrate 的培養(yǎng)基中直接觀察。
6.6 對(duì)于懸浮細(xì)胞,輕輕震蕩重懸細(xì)胞。熒光酶標(biāo)儀設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)488 nm和發(fā)射波長(zhǎng)520 nm。建議貼壁細(xì)胞使用底部閱讀方式。貼壁細(xì)胞密度的變化可能導(dǎo)致不準(zhǔn)確的讀數(shù)。
運(yùn)輸及保存方法
1、細(xì)胞可用Hoechst 33342 染料(推薦濃度1 μM)共染,使細(xì)胞核產(chǎn)生藍(lán)色熒光染色(Ex/Em=346/460 nm)。
2、488 染料可用甲醛固定,但與甲醇固定不兼容。
3、經(jīng)甲醛固定的488染色細(xì)胞可用0.1% TritonX-100處理后行后續(xù)染色,但這樣處理后的染色亮度可能會(huì)減弱。
4、操作時(shí)請(qǐng)采取防護(hù)措施,穿防護(hù)服、戴一次性手套等。
5、本產(chǎn)品僅作科研用途!
貨號(hào) | 品名 | 規(guī)格 | 品牌 |
78DC10160-25T | 488 Caspase-3活細(xì)胞分析試劑盒 | 25T | BIOHUB |
78DC10160-100T | 488 Caspase-3活細(xì)胞分析試劑盒 | 100T | BIOHUB |
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