抗體標記(僅供參考)
試驗材料:
藻紅蛋白:分子量約 240000 道爾頓;PD-10 柱(葡聚糖凝膠層析柱 Sephadex G-25M) ,安瑪西亞 Amersham公司產品,產品目錄號 No. 17-0851-01; NAP5 柱(葡聚糖凝膠層析柱 Sephadex G-25 DNA grade), 安瑪西亞Amersham 公司產品,產品目錄號 No 17-0853-02;琥珀酰亞胺-4-(N- 甲基馬來酰亞胺)環(huán)已烷-1-碳酸酯)(SMCC),Pierce 公司,產品目錄號 No.22360;N-乙基馬來酰胺(NEM),Sigma 公司,產品目錄號 E-1271;二甲基亞砜(DMSO),Aldrich 公司,產品目錄號 No. 27,685-5。
試驗方法:
1、藻紅蛋白溶液
將藻紅蛋白沉淀復溶為溶液,用脫鹽柱或超濾管除鹽并將其緩沖液置換為20mM 磷酸鹽緩沖液,調整藻紅蛋白的最終濃度為5-10毫克/毫升。
2、藻紅蛋白的衍生化
將琥珀酰亞胺-4-(N-甲基馬來酰亞胺)環(huán)已烷-1-碳酸酯)(SMCC)溶解于無水二甲基亞砜(DMSO)配制成 10毫克/毫升的母液,每毫克的藻紅蛋白添加 11 微升的琥珀酰亞胺-4-(N-甲基馬來酰亞胺)環(huán)已烷-1-碳酸酯)
(SMCC),鋁箔封好后于室溫旋轉反應 60 分鐘,使藻紅蛋白分子上的氨基與琥珀酰胺反應生成衍生化的藻紅蛋白。交換緩沖液預先平衡凝膠層析柱,將衍生化的藻紅蛋白過柱,收集藻紅蛋白峰。
3、抗體的處理
二硫蘇糖醇(DTT)溶解于蒸餾水中,配制成 1 摩爾/升的二硫蘇糖醇(DTT)母液,調整抗體的濃度,使其濃度至少為 4 毫克/毫升。
每毫升抗體溶液中加入 20 微升的二硫蘇糖醇(DTT)母液,室溫靜置反應 40 分鐘,將抗體的二硫鍵打開形成巰基。交換緩沖液預先平衡凝膠柱,將反應液過柱,收集抗體部分。
4、藻紅蛋白和抗體的共價交聯
每毫克抗體加入 3.2 毫克的琥珀酰亞胺-4-(N-甲基馬來酰亞胺)環(huán)已烷-1-碳酸酯)(SMCC)衍生化的藻紅蛋白,鋁箔封好后于室溫旋轉反應 60 分鐘,使藻紅蛋白分子上的馬來酰亞胺基和抗體上的巰基實現共價交聯。
10 毫克的 N-乙基馬來酰胺(NEM)溶解于 1.0 毫升的無水二甲基亞砜(DMSO)中制成 N-乙基馬來酰胺(NEM)母液(現配現用)。每毫克抗體中加入 3.4 微升N-乙基馬來酰胺(NEM)母液,鋁箔封好后于室溫旋轉反應 60 分鐘, 反應后,使抗體上的巰基封閉。
5、交聯物的存儲
將交聯物于存儲緩沖液中透析后保存于2-8℃。