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Alamar Blue 阿爾瑪藍(lán)細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑說明書

更新時(shí)間:2023-10-24      點(diǎn)擊次數(shù):306

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產(chǎn)品描述

  阿爾瑪藍(lán)(Alamar Blue)是一種細(xì)胞活力檢測試劑,包含一種具細(xì)胞膜滲透性、無毒性且弱藍(lán)色熒光的指示劑,即刃天青 (resazurin)。自從1993年開始刃天青就作為一種值得信賴和可靠的試劑被引用。阿爾瑪藍(lán)是MTT(噻唑蘭)的有效且無毒 替代物。阿爾瑪藍(lán)能定量檢測人、哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、真菌和支原體細(xì)胞的增殖情況,也能用于細(xì)胞因子生物活性、細(xì)胞活力分 析、體外細(xì)胞毒性確定以及細(xì)胞生長監(jiān)測。


工作原理

刃天青(resazurin)是一種氧化還原(REDOX)指示劑,根據(jù)細(xì)胞代謝還原情況發(fā)生顏色變化。氧化態(tài)的刃天青呈紫藍(lán)色且基本無熒光,其還原態(tài)產(chǎn)物試鹵靈(resorufin)轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色且高度熒光,產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與呼吸活細(xì)胞數(shù)量呈正比。通過檢測 ,呼吸過程中氧化水平,阿爾瑪藍(lán)用作一種定量檢測細(xì)胞活力和毒性的直接指示劑。阿爾瑪藍(lán)的顏色變化可通過普通分光光度計(jì) 檢測吸光度變化,檢測波長為570nm,參考波長為600nm;阿爾瑪藍(lán)的熒光變化可通過熒光光度計(jì)檢測,激發(fā)波長在 530~560nm之間,發(fā)射波長為590nm。


操作說明

一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(測定最佳孵育時(shí)間和細(xì)胞數(shù)量)

1. 每孔加入100微升細(xì)胞懸液(對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞),對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度,一般要做3-5個(gè)細(xì)胞濃度梯度,每個(gè)濃度建議3-6個(gè)復(fù)孔。注:設(shè)置陰性對(duì)照:細(xì)胞培養(yǎng)基中不加入細(xì)胞;陽性對(duì)照:100微升100%還原型Alamar Blue(不含細(xì)胞)。

2. 每孔加入10微升Alamar Blue,陽性對(duì)照孔中加入10微升無菌的超純水。

3. 放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(37,5% CO2)一定時(shí)間,培養(yǎng)基的顏色由靛青藍(lán)開始變成粉紅色就可以進(jìn)入下一步。

4. 推薦用熒光分光光度計(jì)檢測,激發(fā)光波長在530-560 nm之間,發(fā)射光波長為590 nm。

5. 普通分光光度計(jì)在570nm測定吸光度,參考波長600nm。也可用570/630 nm540/600 nm替代。

6. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以細(xì)胞數(shù)量或孵育時(shí)間為橫坐標(biāo)(X軸),Alamar Blue還原率為縱坐標(biāo)(Y軸)。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測定出適合的細(xì)胞數(shù)量或孵育時(shí)間(使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提是實(shí)驗(yàn)的條件要一致)。

a)公式 1:通過吸光值來計(jì)算還原率

Alamar Blue 還原率(%)=[E600×A570-E570×A600]/[(E570′×C600)-E600′×C570] ×100

E600=氧化態(tài) Alamar Blue 600nm 波長的消光系數(shù);

E570=氧化型 Alamar Blue 570nm 波長的消光系數(shù);

A600=檢測孔在 600nm 波長的吸光值;

A570=檢測孔在 570nm 波長的吸光值;

E570=還原態(tài) Alamar Blue 570nm 波長的消光系數(shù);

E600=還原態(tài) Alamar Blue 600nm 波長的消光系數(shù);

C570=陰性對(duì)照孔在 570nm 波長的吸光值(不加細(xì)胞的培養(yǎng)基+Alamar Blue);

C600=陰性對(duì)照孔在 600nm 波長的吸光值(不加細(xì)胞的培養(yǎng)基+Alamar Blue);

b)公式 2:通過熒光值來計(jì)算還原率

Alamar Blue 還原率(%)=(實(shí)驗(yàn)組 FI 590-陰性對(duì)照組 FI 590)/(100%還原態(tài) Alamar Blue 陽性對(duì)照 FI 590-陰性對(duì)照組 FI 590)×100

FI 590=590nm 發(fā)射波長(560nm 激發(fā)波長)下的熒光強(qiáng)度;

6. 繪制在每個(gè)特定細(xì)胞密度或孵育時(shí)間 Alamar Blue 的還原率。

a)對(duì)確定最佳細(xì)胞密度的實(shí)驗(yàn),以細(xì)胞密度的對(duì)數(shù)(log)為 x 坐標(biāo),Alamar Blue 還原率為縱坐標(biāo);

b)對(duì)確定最佳孵育時(shí)間的實(shí)驗(yàn),以孵育時(shí)間為 x 坐標(biāo),Alamar Blue 還原率為縱坐標(biāo);

c)根據(jù)以上曲線圖來確定最佳細(xì)胞密度或孵育時(shí)間。

二、細(xì)胞毒性和細(xì)胞增殖檢測

1. 每孔加入100微升細(xì)胞懸液(對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞),對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。建議細(xì)胞數(shù)量為104/ml,具體每孔需要的細(xì)胞數(shù)量,需根據(jù)細(xì)胞類型決定。

2. 細(xì)胞中加入待檢測藥物,為檢測藥物對(duì)細(xì)胞增殖的作用,請(qǐng)?jiān)O(shè)置合適的對(duì)照組,包括刺激細(xì)胞和非刺激細(xì)胞。

3. 混勻,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育(37,5% CO2)一段時(shí)間。

4. 每孔加入10微升Alamar Blue。陽性對(duì)照孔中加入10微升無菌的超純水。

5. 放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育(37,5% CO24-8h,最佳孵育時(shí)間取決于細(xì)胞類型。培養(yǎng)基的顏色由靛青藍(lán)開始變成粉紅色就可以進(jìn)入下一步。

6. 推薦用熒光分光光度計(jì)檢測,激發(fā)光波長在530-560 nm之間,發(fā)射光波長為590 nm。

7. 普通分光光度計(jì)在570nm測定吸光度,參考波長600nm。也可用570/630 nm540/600 nm替代。

a)公式 3:通過吸光值來計(jì)算還原度的變化百分比

Alamar Blue 還原度變化百分比(%)=[(E600×A570)-(E570×A600)]/[( E600×P570)-(E570×P600)] ×100

E600=氧化態(tài) Alamar Blue 在 600nm 波長的消光系數(shù);

E570=氧化態(tài) Alamar Blue 在 570nm 波長的消光系數(shù);

A600=檢測孔在 600nm 波長的吸光值;

A570=檢測孔在 570nm 波長的吸光值;

P570=陽性對(duì)照孔在 570nm 波長的吸光值(不含待測藥物的細(xì)胞+ Alamar Blue)

P600=陽性對(duì)照孔在 600nm 波長的吸光值(不含待測藥物的細(xì)胞+ Alamar Blue)

結(jié)果判斷:假如 Alamar Blue 還原度變化百分比(%)=62%,說明相對(duì)于對(duì)照孔,檢測孔 Alamar Blue 的還原變化值為 62%,換句話而言,相對(duì)于對(duì)照孔,38%的檢測孔細(xì)胞生長受到抑制。

b)公式 4:通過熒光值來計(jì)算還原度的變化百分比

Alamar Blue 還原度變化百分比(%)=(實(shí)驗(yàn)組 FI 590/陰性對(duì)照組 FI 590×100 FI 590=590nm 發(fā)射波長(560nm 激發(fā)波長)下的熒光強(qiáng)度;

結(jié)果判斷:假如 Alamar Blue 還原度變化百分比(%)=25%,說明相對(duì)于對(duì)照孔,檢測孔 Alamar Blue 還原變化值為 25%,換句話而言,相對(duì)于對(duì)照孔,75%的檢測孔細(xì)胞生長受到抑制。



運(yùn)輸與保存方法

保存:4℃避光保存,至少一年有效。運(yùn)輸:冰袋運(yùn)輸。



注意事項(xiàng)

1) 還原態(tài)的 Alamar Blue 在水或水溶性緩沖液如 PBS 中很不穩(wěn)定,但在培養(yǎng)基內(nèi)非常穩(wěn)定。為了確定特定實(shí)驗(yàn)還原態(tài) Alamar Blue 的吸光度/熒光值,需準(zhǔn)備 100%還原態(tài) Alamar Blue 試劑:將 Alamar Blue與細(xì)胞培養(yǎng)基(含血清)按照 1:10 的比例混合,121℃高壓滅菌 15min 即可。由于熒光值定義比較隨意,儀器不同熒光值都可能發(fā)生變化,因此,測定 100%還原態(tài) Alamar Blue 熒光值時(shí)必須要和樣本測定使用相同的儀器和培養(yǎng)基。


2) 適宜的細(xì)胞密度能夠增加檢測靈敏度。對(duì)于 96 孔板,建議每孔接種 100μl 細(xì)胞,細(xì)胞濃度范圍:貼壁細(xì)胞為 100-10,000 個(gè)/孔,懸浮細(xì)胞在 2,000-50,000 個(gè)/孔,以培養(yǎng)基為空白對(duì)照。對(duì)于 384 孔板,細(xì)胞濃度和接種量均減半。


3) 影響細(xì)胞對(duì) Alamar Blue 反應(yīng)的兩大變量為孵育時(shí)間和鋪板密度,建議實(shí)驗(yàn)前需先摸索優(yōu)化這兩個(gè)因素。細(xì)胞密度過高或孵育時(shí)間過長都會(huì)導(dǎo)致繼發(fā)性還原反應(yīng),紅色產(chǎn)物停止增加并開始衰減,導(dǎo)致吸光度/熒光水平明顯下跌并伴隨紅色消失。


4) 微生物污染會(huì)還原 Alamar Blue。因此對(duì)被污染細(xì)胞使用 Alamar Blue 檢測會(huì)引起錯(cuò)誤結(jié)果。


5 Alamar Blue 可以用分光光度計(jì)或熒光計(jì)檢測,但熒光靈敏度高,實(shí)驗(yàn)誤差小,推薦熒光檢測。


6) 為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。


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