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mRNA疫苗相關(guān)產(chǎn)品-起發(fā)生物

更新時間:2023-08-24      點擊次數(shù):205

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mRNA疫苗相關(guān)產(chǎn)品-起發(fā)生物

 

一、mRNA疫苗生產(chǎn)可分為兩大塊:mRNA制備和脂質(zhì)微粒進(jìn)行包封

mRNA疫苗生產(chǎn)可分為兩大塊,可以類比為原料藥"mRNA)的生產(chǎn)和純化,以及制劑"(利用脂質(zhì)微粒進(jìn)行包封)階段。原料藥(mRNA)生產(chǎn)涉及DNA原液制備和mRNA原液的制備,mRNA原液的制備(體外轉(zhuǎn)錄),是整個mRNA工藝流程中核心的步驟,而原料主要是酶。

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()mRNA疫苗的生產(chǎn)

mRNA疫苗生產(chǎn)可分為兩大塊,原料藥(mRNA)的生產(chǎn)以及制劑(利用脂質(zhì)微粒進(jìn)行包封)階段。mRNA生產(chǎn)涉及DNA原液制備和mRNA原液的制備。所以mRNA疫苗的生產(chǎn)可分為三大階段,第一步DNA原液制備,第二步mRNA原液的制備,第三步是利用脂質(zhì)微粒進(jìn)行包封。

第一步:DNA模板生產(chǎn),主要是質(zhì)粒生產(chǎn)。編碼抗原的DNA模板生產(chǎn),常用大腸桿菌大規(guī)模體內(nèi)表達(dá),最后提取和純化攜帶目的序列的質(zhì)粒;

第二步:mRNA原液的制備轉(zhuǎn)錄,由DNAmRNA。在無細(xì)胞的反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,通過T7SP6T3RNA多聚酶作用,通過一步或者兩步法轉(zhuǎn)錄成為mRNA,同時加上5’Cap3’PolyA尾巴,在進(jìn)一步使用DNA酶將殘留的DNA模板進(jìn)行消除;純化,使用離子交換等層析步驟進(jìn)一步將轉(zhuǎn)錄形成的mRNA進(jìn)行純化,進(jìn)行超濾濃縮形成原液;

第三步:制劑階段,利用脂質(zhì)微粒進(jìn)行包封。通過微流體泵精確地控制著mRNA原液和脂質(zhì)流速,將他們混合成脂質(zhì)納米粒LNP。最后則是成品的灌裝及質(zhì)量控制,貼簽形成終產(chǎn)品。

 二、mRNA合成過程所需原料

(一)國內(nèi)外mRNAxin冠疫苗的合成工藝

BioNTech/輝瑞、Moderna和艾博生物mRNA疫苗的合成工藝如下:

1BNT162b2–BioNTech/輝瑞

三核苷酸cap1類似物((m27,3′-OGpppm2'-OApG)(TriLink)和N1-甲基假尿苷-5′-三磷酸(m1ψTP)(ThermoFisherScientific)取代尿苷-5′-三磷酸(UTP)的存在下,通過T7RNA聚合酶對DNA進(jìn)行純化和體外轉(zhuǎn)錄。

總結(jié):轉(zhuǎn)錄采用一步法,帽子類似物作引物;甲基假尿苷取代尿苷。

2mRNA-1273–Moderna

利用優(yōu)化的T7RNA聚合酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在體外合成了編碼序列優(yōu)化的mRNA,尿苷被N1-甲基假尿苷wan全取代。轉(zhuǎn)錄后,使用牛痘苗封蓋酶(新英格蘭生物實驗室)和痘苗2′O-甲基轉(zhuǎn)移酶(新英格蘭生物實驗室)將Cap1結(jié)構(gòu)添加到5’端。通過oligodT親和純化純化mRNA,通過切向流過濾將緩沖液交換到pH5.0的醋酸鈉中,無菌過濾,并在-20°C下冷凍,直到進(jìn)一步使用。

總結(jié):轉(zhuǎn)錄采用兩步法,需要加帽酶的參與,甲基假尿苷取代尿苷。

3ARCoV-艾博生物

mRNA在體外使用T7RNA聚合酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄從質(zhì)粒ABOP-028GENEWIZ)的線性化DNA模板中產(chǎn)生,該質(zhì)粒編碼SARS-CoV-2的密碼子優(yōu)化RBD區(qū)域,并包含5’3‘的未翻譯區(qū)域(UTR)和一條poly-a尾巴,以未修飾的NTP作為原料和T7聚合酶體外進(jìn)行mRNA的合成,使用了牛痘加帽系統(tǒng)(VacciniaCappingSystem(Novoprotein)進(jìn)行加帽。

總結(jié):轉(zhuǎn)錄采用兩步法,需要加帽酶的參與。

(二)mRNA制備過程原料

mRNA制備過程需要用到的主要原料包括質(zhì)粒DNA模板、一系列酶(主要為7種酶)以及底物核苷酸等;

1、模板DNA所需原料:質(zhì)粒

DNA模板生產(chǎn),主要是質(zhì)粒的生產(chǎn)。編碼抗原的DNA模板,通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到大腸桿菌大規(guī)模體內(nèi)表達(dá),最后提取和純化攜帶目的序列的質(zhì)粒,即得到DNA模板。目前質(zhì)粒的生產(chǎn)提取和純化工藝很成熟,可以自建生產(chǎn)線或者外包出去,例如輝瑞自建質(zhì)粒生產(chǎn)工廠,大部分mRNA企業(yè)外包,Moderna和國內(nèi)企業(yè)目前是外包。

制備mRNA質(zhì)粒的要求:質(zhì)粒用于制備mRNA,這類DNA本身不屬于API,DNA需要按照GMP規(guī)范進(jìn)行,GMP質(zhì)粒要求生產(chǎn)設(shè)備必須是專用的、符合GMP規(guī)范且配備潔凈間。

 2、mRNA體外轉(zhuǎn)錄所需原料:一系列酶+核苷酸底物

mRNA疫苗的研發(fā)與生產(chǎn)需要一系列酶的參與:mRNAT7聚合酶、無機焦磷酸酶、RnaseInhibitor、加帽酶以及2′O-甲基轉(zhuǎn)移酶、Poly(A)聚合酶和DNAase等主要7種酶。

如下表:

產(chǎn)品編號

產(chǎn)品名稱

品牌

78MRNA-1001

ATP-Solution(100mM)

BIOHUB

78MRNA-1002

CTP-Solution(100mM)

BIOHUB

78MRNA-1003

GTP-Solution(100mM)

BIOHUB

78MRNA-1004

UTP-Solution(100mM)

BIOHUB

78MRNA-1005

NTPBundle(100mM)

BIOHUB

78MRNA-1101

N1-Methyl-Pseudo-UTP(100mM)

BIOHUB

78MRNA-1102

Pseudo-UTP(100mM)

BIOHUB

78MRNA-1103

RNaseInhibitor-recombinant(40000U/mL)

BIOHUB

78DA10001

RecombinantRNaseInhibitor(Porcine)(40000U/mL)

BIOHUB

78MRNA-1104

T7RNAPolymerase(1KU/μL)

BIOHUB

78MRNA-1105

Vaccinia CappingEnzyme(10KU/mL)

BIOHUB

78MRNA-1106

mRNACap2′-O-Methyltransferase(50U/μL)

BIOHUB

78MRNA-1107

EGFPmRNA(Pseudouridine,Ψ)

BIOHUB

78MRNA-1109

InorganicPyrophosphatase

BIOHUB

78MRNA-1110

DeoxyribonucleaseI(DNaseI)

BIOHUB

78MRNA-1111

S-adenosylmethionine(SAM)(32mM)

BIOHUB

78MRNA-1112

5-Methyl-CTP(100mM)

BIOHUB

78MRNA-1113

5-Methoxy-UTP(100mM)

BIOHUB

 

2.1轉(zhuǎn)錄過程所需要的酶

RNA聚合酶體系RNA聚合酶是體外轉(zhuǎn)錄mRNA的關(guān)鍵酶。

T3、T7SP6RNA聚合酶分別對T3、T7SP6噬菌體啟動子具有高度的特異性。將目的基因序列克隆到T7SP6啟動子下游的多克隆位點中,以克隆的DNA為模板體外合成相應(yīng)的RNA

T7RNAPolymeraseT7RNA聚合酶)78MRNA-1104高度特異識別T7啟動子序列,以含有T7啟動子序列的單鏈或雙鏈DNA為模板,以核甘酸(NTP)為底物,合成與啟動子下游的單鏈DNA互補的RNA。

無機焦磷酸酶78MRNA-1109加入無機焦磷酸酶,增加RNA產(chǎn)量。無機焦磷酸酶(PPase)可催化無機焦磷酸鹽水解生成正磷酸鹽,可以為蛋白、RNADNA的生物合成反應(yīng)提供動力,促進(jìn)產(chǎn)物的生成。在工業(yè)化生產(chǎn)mRNA疫苗的時候會產(chǎn)生大量的無機焦磷酸鹽,為了保證mRNA疫苗高效生產(chǎn),可以添加無機焦磷酸酶,可解除生成的無機焦磷酸鹽對反應(yīng)體系的抑制。

RNase抑制劑78MRNA-1103/78DA10001:防止RNA的降解。少量RNaseRNA制備過程中引入,會導(dǎo)致RNA的降解,污染可能通過實驗過程中使用的槍頭、試管(離心管)和其他試劑引入。通常使用RNase抑制劑作為減少和控制此類污染物的預(yù)防措施。

RNase抑制劑能與RNaseA形成1:1復(fù)合體,抑制RNase活性,在mRNA疫苗研發(fā)和生產(chǎn)過程需要保持mRNA的穩(wěn)定性以保證疫苗高質(zhì)量的生產(chǎn)。

2、轉(zhuǎn)錄所需材料-核苷酸和修飾核苷酸

mRNA疫苗研發(fā)中常進(jìn)行假尿嘧啶化修飾,尿嘧啶修飾是zui豐富的RNA修飾,一般由尿苷的異構(gòu)化產(chǎn)生,mRNA的假尿嘧啶化修飾主要有三個功能:改變密碼子、增強轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性和應(yīng)激反應(yīng)應(yīng)答。

3、加帽和加尾:共轉(zhuǎn)錄加帽/模板加尾,轉(zhuǎn)錄后加帽/加尾

真核生物體內(nèi)會對轉(zhuǎn)錄形成的mRNA進(jìn)行加帽,即在mRNA5’端添加一個甲基化的鳥苷酸帽子(m7GPPPN結(jié)構(gòu)),從而保護mRNA免遭核酸外切酶的攻擊以增加mRNA的穩(wěn)定性,并且協(xié)助mRNA與核糖體的結(jié)合以促進(jìn)翻譯起始。生物體內(nèi)的帽子結(jié)構(gòu)有cap0,cap1cap2三種形式,牛痘病毒加帽酶能夠在mRNA5’端添加cap0帽子,再使用甲基轉(zhuǎn)移酶處理即可得到cap1帽子。

此外,5'帽子還參加mRNA前體的剪接,參與mRNA3'末端多聚腺苷酸化,保證mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定運輸。

加帽需要的酶:牛痘病毒加帽酶

可以將7-甲基鳥苷帽結(jié)構(gòu)(m7Gppp,Cap0)加到RNA5末端,大幅提高mRNA的穩(wěn)定性和啟動mRNA的翻譯。牛痘病毒加帽酶能夠在一小時之內(nèi)對mRNA進(jìn)行加帽,效率接近100%。

mRNA疫苗研發(fā)生產(chǎn)過程中,mRNA加帽效率和加帽mRNA穩(wěn)定表達(dá)的效率對疫苗的工業(yè)化生產(chǎn)有重大的影響。牛痘病毒加帽酶體系加帽的mRNA在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)效率大于帽子類似物mRNA的表達(dá)效率。

加尾酶:Poly(A)聚合酶

Poly(A)聚合酶可以催化ATPAMP的形式依次摻入到RNA3末端,即在RNA3末端加多聚A尾。Poly(A)尾巴能夠增強mRNA的穩(wěn)定性、提高翻譯起始效率、引導(dǎo)mRNA出核。

主要用到的酶:

1)牛痘病毒加帽酶78MRNA-1105

2)痘苗2′O-甲基轉(zhuǎn)移酶78MRNA-1106

3Poly(A)聚合酶

加帽酶非常昂貴,如何替代加帽酶?

一步法合成mRNA疫苗產(chǎn)品的加帽可以在mRNA的體外轉(zhuǎn)錄過程中通過摻入帽子序列"實現(xiàn),這種加帽技術(shù)會將加帽序列反向加在mRNA上,在反應(yīng)體系中加入5’帽類似物,可以省一個加帽酶,以及減少純化步驟,一定程度上降低成本(尤其是節(jié)省了昂貴的加帽酶成本),但相對應(yīng)地,產(chǎn)量較之兩步法(加帽酶參與)減少,因為加帽酶的加帽效率更高。

4、消除DNA模板:需要DNA78MRNA-1110

合成后的產(chǎn)物可能會有DNA殘留,在疫苗開發(fā)階段,殘留的去除是關(guān)鍵的步驟,以減少下游純化難度并增加產(chǎn)品的純度。需要用DNA酶(DNAase將殘留的DNA模板進(jìn)行消除,在mRNA疫苗生產(chǎn)的過程中對DNA的殘留控制非常嚴(yán)格格。

二、關(guān)于遞送系統(tǒng)(LNP)原料

mRNA分子量大、親水性強,但自身的單鏈結(jié)構(gòu)致使其極為不穩(wěn)定,易被降解,自身攜帶負(fù)電荷,穿過表面同為負(fù)電荷的細(xì)胞膜遞送是難題,所以需要特殊的修飾或包裹遞送系統(tǒng)才能實現(xiàn)mRNA的胞內(nèi)表達(dá),遞送技術(shù)是mRNA公司的核心專li技術(shù)。

脂質(zhì)納米顆粒(Lipidnanoparticle,LNP)是目前主流的遞送載體方式。由于其比較容易被抗原呈遞細(xì)胞吸收,因此最常被用于疫苗,目前三大mRNA疫苗ju頭企業(yè),ModernaCureVacBioNTech xin冠疫苗均采用了LNP遞送技術(shù)。

此外還有陽離子脂質(zhì)復(fù)合物(lipoplex,LPX)、脂質(zhì)多聚復(fù)合物(lipopolyplex,LPP)、聚合物納米顆粒(Polymernanoparticles,PNP)、無機納米顆粒(InorganicnanoparticlesINP)陽離子納米乳(Cationicnanoemulsion,CNE),以及瑞博生物自主研發(fā)的GalNacN-乙酰半乳糖胺技術(shù),能夠進(jìn)行肝臟的定點傳遞。

 (一)LNP為主流的遞送載體方式

zui廣泛應(yīng)用的LNP組成成分:聚乙二醇脂質(zhì)、膽固醇、合成磷脂、可電離陽離子脂質(zhì)、mRNA。目前上市的mRNA疫苗成分主要有以下5種:

1mRNA

2)陽離子脂質(zhì),與帶負(fù)電的mRNA結(jié)合,LNP最關(guān)鍵的成分;

3)膽固醇,介導(dǎo)LNP內(nèi)吞,以及穩(wěn)定LNP結(jié)構(gòu)(膽固醇有助于增加細(xì)胞膜的流動性或硬度,加入膽固醇能提高納米顆粒的穩(wěn)定性);

4)磷脂酰膽堿,輔助型脂質(zhì),可以在內(nèi)吞時加快mRNA的釋放;

5)聚乙二醇化磷脂,延長代謝時間,提高LNP穩(wěn)定性。

 1、陽離子脂質(zhì)體:LNP最關(guān)鍵的成分,是LNP逃離內(nèi)體的關(guān)鍵成分

目前Moderna、輝瑞、BioNTech,Curevac,Acuitas,Genevant等公司都自行篩選或授權(quán)從其他公司購買的陽離子類脂質(zhì)分子作為主要遞送材料,每家公司材料具體結(jié)構(gòu)各不相同,但都屬于特定條件下戴正電荷的陽離子脂質(zhì)。

陽離子脂質(zhì)體開發(fā),在遞送效率和細(xì)胞毒性之間平衡。可電離陽離子脂質(zhì)作用是LNP遞送系統(tǒng)的關(guān)鍵,提高mRNA的體內(nèi)穩(wěn)定性,并幫助mRNA逃避溶酶體的降解。

在生產(chǎn)原液時,將mRNA和陽離子脂質(zhì)體在特定PH值下混合一起,則陰離子mRNA就會和陽離子脂質(zhì)體產(chǎn)生靜電吸引融合在一起,一旦LNP被細(xì)胞吸收,核內(nèi)體的低pH環(huán)境將會融合LNP,從而釋放mRNA進(jìn)入胞質(zhì)溶膠。

陽離子脂質(zhì)作為載體有著廣闊的應(yīng)用前景,一些陽離子脂質(zhì)會引起細(xì)胞毒性。陽離子脂質(zhì)的細(xì)胞毒性取決于其親水性頭基的結(jié)構(gòu),含有季銨頭基的兩親分子比含有叔胺的兩親分子毒性更大。陽離子有細(xì)胞毒性,解決對人體的副反應(yīng)是關(guān)鍵,可電離陽離子脂質(zhì)是LNP技術(shù)的核心,也是專li保護的重點。

2、非陽離子脂質(zhì):膽固醇,介導(dǎo)LNP內(nèi)吞,穩(wěn)定LNP結(jié)構(gòu)

膽固醇有利于確保LNP的雙層結(jié)構(gòu)及脂質(zhì)的流動性。中性脂質(zhì)(如各種磷脂)也是用于構(gòu)建LNP雙層結(jié)構(gòu)的,因為陽離子脂質(zhì)體的雙層結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定。

3、PEG-lipid

PEG修飾的脂質(zhì)體形成親水保護層,維持LNP空間的穩(wěn)定性,聚乙二醇在顆粒表面可屏蔽血漿蛋白等成分結(jié)合顆粒,以避免LNP顆粒在體內(nèi)被清除。

PEG-脂質(zhì)結(jié)合物也可能引起不期望的毒性,含有PEGLNP已知脂質(zhì)結(jié)合物與免疫細(xì)胞相互作用,產(chǎn)生針對某些聚乙二醇化脂質(zhì)的不希望出現(xiàn)的抗體。

4、磷脂酰膽堿,輔助型脂質(zhì),可以在內(nèi)吞時加快mRNA的釋放。

5、其他賦形劑:有利于穩(wěn)定pH、溫度等。

(二)LNP遞送系統(tǒng)專li壁壘

LNP遞送系統(tǒng)的核心壁壘其實是材料的專li。Arbutus公司在2009年持有的US8058069號專li和2015年在中國申請的CN1021192178專li對于核酸和陽離子脂質(zhì)混合物進(jìn)行了非常全面的保護,對于幾乎所有陽離子脂質(zhì)和核酸和混合物,都進(jìn)行了覆蓋,預(yù)計到2029年到期,到期之前專li保護難以撼動。

069核心專li內(nèi)容:

包含一種或多種活性劑或治療劑的新型穩(wěn)定脂質(zhì)顆粒、制備脂質(zhì)顆粒的方法和遞送和/或施用脂質(zhì)顆粒的方法;更具體地,包含核酸(例如一種或多種干擾RNA)的穩(wěn)定核酸-脂質(zhì)顆粒(SNALP)、制備SNALP的方法和遞送和/或施用SNALP的方法;一種核酸-脂質(zhì)顆粒,包括:

(a)核酸;

(b)占顆粒中總脂質(zhì)的50mol%65mol%的陽離子脂質(zhì);

(c)包含磷脂和膽固醇或其衍生物的混合物的非陽離子脂質(zhì),其中磷脂占顆粒中存在的總脂質(zhì)的4mol%10mol%,膽固醇或其衍生物占顆粒中存在的總脂質(zhì)的30mol%40mol%;

(d)抑制顆粒聚集的綴合脂質(zhì),其占顆粒中總脂質(zhì)的0.5mol%2mol%

(三)脂質(zhì)包封過程所需原料

1LNP遞送系統(tǒng)的關(guān)鍵原料:可離子化脂質(zhì)、PEG脂質(zhì)、DSPC脂質(zhì)、膽固醇。

LNP直徑為80-100nm,每個脂質(zhì)納米粒含有約100mRNA分子。以ModernamRNA-1273疫苗為例:脂質(zhì)壁由四種不同的化合物組成,

1SM-102——專有陽離子脂質(zhì),是構(gòu)成納米顆粒壁的基本結(jié)構(gòu)

2DSPC——磷脂酰膽堿,助力納米顆粒的壁結(jié)構(gòu)

3)膽固醇——膽固醇存在于人體所有的細(xì)胞膜中,根據(jù)溫度的不同,膽固醇有助于增加細(xì)胞膜的流動性或硬度,加入膽固醇能提高納米顆粒的穩(wěn)定性。

4PEG-2000DMG——一種融于聚乙二醇的脂質(zhì),能幫助納米顆粒的形成。

專有陽離子脂質(zhì)ALC-0315(輝瑞)和SM-102Moderna)這兩種脂質(zhì)都是叔胺,在低pH值下質(zhì)子化(因此帶正電),在mRNA傳遞后實現(xiàn)安全清除。PEG脂質(zhì)都是PEG-2000結(jié)合物。

LNPmRNA的顆粒是通過自組裝形成,通過兩種液體按照適當(dāng)?shù)牡牧魉俸团浔刃纬?。基本原理?/span>T型管一端是RNA的水溶液,一端是脂質(zhì)的乙醇溶液,通過兩相的快速混合,從而讓LNP完成自主裝,需要控制水相和乙醇相的流速比,設(shè)計管道的形狀。

 脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)在很大程度上取決于它們的制備方法。脂質(zhì)體可以是直徑20-100nm的單層(小的單層)囊泡(SUV),直徑為100-1000nm的大單層囊泡(LUV-1000nm或直徑>1000nm的巨大單層囊泡(GUV)或直徑>500nm的多層囊泡(MLV)。藥物輸送系統(tǒng)主要使用SUV和小型MLV,而GUV主要用作細(xì)胞模型。粒徑是決定脂質(zhì)體藥物包封率和循環(huán)半衰期的一個關(guān)鍵參數(shù),較小的脂質(zhì)體更有可能逃脫吞噬細(xì)胞的攝取。

脂質(zhì)納米顆粒生產(chǎn)過程:LNP是在低pHpH4.0)下制備的,此時可電離脂質(zhì)帶正電荷,因此它很容易與每個脂質(zhì)納米粒約100mRNA分子形成復(fù)合物。微流控裝置用于將水中含有mRNA的流與乙醇中含有脂質(zhì)混合物的流混合。當(dāng)快速混合時,這兩種流的成分形成納米粒,將帶負(fù)電的mRNA包埋。

如何組裝LNPmRNA疫苗生產(chǎn)最大的Know-how,需要控制LNP的組分、粒度、流量、流體形態(tài)等參數(shù),來完成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的納米微粒組裝。目前從微流控到T型混合裝置核心技術(shù)掌握在極少數(shù)企業(yè)手中。

BioNTech/Pfizer xin冠疫苗的納米脂質(zhì)體顆粒(LNPs)生產(chǎn)采用沖擊式射流混合法,,采用高壓泵,讓mRNA溶液和脂質(zhì)體溶液形成兩股射流,在一個腔體中進(jìn)行對沖,從而產(chǎn)生劇烈的湍流。這種湍流能讓LNP各個組分充分地混合,從而形成包裹mRNA的納米脂質(zhì)體。

采用德國Knauer研發(fā)生產(chǎn)的IJM(碰撞噴射混合器)。規(guī)?;a(chǎn)的沖擊式射流混合器結(jié)構(gòu)和參數(shù)是根據(jù)Moerna、BioNTech等企業(yè)需求量身定制。


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