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手把手教你做出RT-qPCR最美曲線系列:如何正確選擇逆轉(zhuǎn)錄引物?

更新時間:2023-08-24      點擊次數(shù):223


1. Oligo(dT)


Oligo(dT)是多聚胸腺嘧啶、T重復(fù)寡核苷酸,就是只有胸腺嘧啶組成的核苷酸鏈。因為Oligo(dT)與mRNA的Poly(A)尾巴可以發(fā)生特異性結(jié)合,所以用Oligo(dT)特異結(jié)合到mRNA上Poly(A)尾端,因此,主要用于逆轉(zhuǎn)帶有Poly(A)尾的mRNA。例如模板為真核生物來源,Oligo(dT)可與mRNA的3’Poly(A)尾配對,有利于長鏈或全長mRNA的逆轉(zhuǎn)錄。但是,其對RNA樣品的質(zhì)量要求較高,不允許其降解,否則全長cDNA合成量會大量減少。

2. 隨機引物

隨機引物是指當(dāng)特定mRNA由于含有使逆轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時,可采用隨機六聚體這一不特異的引物來拷貝全長mRNA,一般6到8個堿基,許多隨機引物組成一套引物組。它可用于mRNA、rRNA、tRNA等各種RNA的逆轉(zhuǎn)錄,對于目標(biāo)區(qū)域具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)/GC含量較高,或者來源為原核生物的模板也同樣適應(yīng)。

3. 基因特異性引物

基因特異性引物(GSP)是某個基因序列的一部分,與模板互補的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進行設(shè)計的。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合,每個目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此,當(dāng)分析多種目標(biāo)時,則需要適用更多的RNA樣本。通常特異性引物用于一步RT-qPCR實驗中。


 


PART 02

逆轉(zhuǎn)錄引物優(yōu)劣勢比較


 

引物類型

結(jié)合部位

優(yōu)點

缺點

Oligo(dT)

真核生物mRNA3’端poly(A)尾

可合成全長cDNA

1、僅擴增有polyA尾的mRNA

2、對模板質(zhì)量要求高

隨機引物

RNA的許多隨機可結(jié)合部位

適合復(fù)雜結(jié)構(gòu)和微量模板

特異性低,小片段多

基因特異性引物

特異性互補序列

特異性強,靈敏度高

僅合成特定的序列




PART 03

逆轉(zhuǎn)錄引物的選擇

RNA類型:

1、真核生物mRNA

2、miRNA、核糖體RNA和tRNA等小RNA前體加A尾處理后的模板

引物選擇:

Oligo(dT)

原因:

1、真核生物mRNA含有poly(A)尾,可以O(shè)ligo(dT)引物結(jié)合

2、miRNA、rRNA和tRNA本身無A尾,故需要人工處理后才能與Oligo(dT)引物結(jié)合

 

RNA類型:

1、rRNA、tRNA、原核生物mRNA等無3’端poly(A)尾的模板

2、長度比較長、有二級結(jié)構(gòu)存在及微量樣本的模板

引物選擇:

隨機引物

原因:

隨機引物可以在任意位點和RNA結(jié)合并開始反轉(zhuǎn)

 

RNA類型:

1、已知基因序列的模板

2、miRNA增加莖環(huán)結(jié)構(gòu)的模板

引物選擇:

基因特異性引物

原因:

1、針對特定序列設(shè)計的反轉(zhuǎn)錄引物

2、miRNA(莖環(huán)法)的反轉(zhuǎn)錄,需要根據(jù)基因序列設(shè)計對應(yīng)的引物

 

:為提高反轉(zhuǎn)錄效率,并保障獲得更加完整的cDNA,建議將Oligo(dT)和隨機引物混合使用。

 

PART 04

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RNA類型

引物選擇

原因

1、真核生物mRNA

2、miRNA、核糖體RNA和tRNA等小RNA前體加A尾處理后的模板

Oligo(dT)

1、真核生物mRNA含有poly(A)尾,可以O(shè)ligo(dT)引物結(jié)合

2、miRNA、rRNA和tRNA本身無A尾,故需要人工處理后才能與Oligo(dT)引物結(jié)合

1、rRNA、tRNA、原核生物mRNA等無3’端poly(A)尾的模板

2、長度比較長、有二級結(jié)構(gòu)存在及微量樣本的模板

隨機引物

隨機引物可以在任意位點和RNA結(jié)合并開始反轉(zhuǎn)。

1、已知基因序列的模板

2、miRNA增加莖環(huán)結(jié)構(gòu)的模板

基因特異性引物

1、針對特定序列設(shè)計的反轉(zhuǎn)錄引物

2、miRNA(莖環(huán)法)的反轉(zhuǎn)錄,需要根據(jù)基因序列設(shè)計對應(yīng)的引物






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